胎盘组织中GLUT、IRS、SHBG表达与妊娠期糖尿病关系

任丽芳，马玉珍，何金英

(内蒙古自治区人民医院 1.妇产科；2.妇产科医学生殖中心，内蒙古 呼和浩特 010010)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)指妊娠期间发生糖耐量异常，是妊娠期常见的并发症之一[1]。随着现代亚健康生活方式、肥胖人口增多以及孕妇平均生育年龄的上升，近年来GDM发病率逐渐上升。流行病学数据显示2015年全球妊娠期血糖增高患者为16.2%，其中GDM患者高达85.0%[2]。妊娠期血糖增高若未经及时有效治疗可对孕妇生命健康、胎儿发育以及胎儿结局产生严重不良影响[3]。有研究发现孕妇胎盘组织中葡萄糖转运蛋白(glucose transporters，GLUT)、胰岛素信号转导蛋白(insulin receptor substrates，IRS)、性激素结合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)水平表达与GDM紧密相关，其对GDM的发病程度和预后情况都具有明显判定价值[4]。因此，本研究主要通过对GDM孕妇胎盘组织中的GLUT、IRS、SHBG水平表达进行分析，探讨这些指标表达水平及与GDM发病的关系。

1资料与方法

1.1研究对象

选取2017年12月至2018年12月期间在内蒙古自治区人民医院妇产科定期产检并且行剖宫产的GDM孕妇42例作为研究组。纳入标准：①符合GDM的诊断标准[5]，并经临床确诊；②既往无糖尿病史或其他慢性病史；③妊娠37～42周，有剖宫产手术指征；④无其他妊娠期并发症；⑤按时产检且病历资料完整。排除标准：①既往有糖尿病史或其他慢性病史；②有胎儿畸形、流产、死胎分娩史；③合并心、肺、肝、肾等重要器官功能损害者。另选取同一时期行剖宫产的健康孕妇42例作为对照组，对照组各项产检指标正常，排除标准同研究组。所有研究对象由本院检验科检测空腹血糖、口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT)2h血糖、促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、游离甲状腺素4(free thyroxine 4，FT4)。本次研究已获得所有研究对象知情同意，且经我院医学伦理委员会批准。

1.2研究标本

当产妇分娩胎盘随之娩出时迅速在脐带附着处剪取3块1cm3的绒毛组织，采用生理盐水洗净并作吸干处理，于冻存管中经液氮速冻4h，再保存在-80℃条件下备用。

1.3研究试剂

qPCR检测中所需要的RNA引物、Trizol试剂盒、cDNA逆转录试剂盒、实时PCR试剂盒均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。Western blot检测中所需要的鼠抗人GLUT-1单克隆抗体、兔抗人GLUT-3单克隆抗体、兔抗人GLUT-4单克隆抗体，兔抗人IRS-1单克隆抗体、兔抗人IRS-2单克隆抗体、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，P13K)p85α单克隆抗体，SHBG单克隆抗体均购自武汉贝茵莱生物科技有限公司。

1.4研究方法

1.4.1 qPCR检测

提取冻存已裂解的GDM胎盘组织和健康孕妇胎盘组织各100mg，采用Trizol试剂提取胎盘组织总RNA，测定浓度、纯度合格后将RNA逆转录得到cDNA，再通过实时定量PCR仪(型号ABI 7300)扩增。反应体系30μL，反应条件：于95℃下持续10min，预变性，再于95℃下持续15s变性；60℃退火且延伸45s，一共进行40个循环。每组实验重复3次，然后采用2(-△△CT)法对目的基因的相对表达量进行计算处理。

1.4.2 Western blot检测

提取妊娠合并糖尿病胎盘组织和健康孕妇胎盘组织，加入蛋白裂解液并充分裂解(4℃条件下，12 000r/min，离心10min)，收集上清总蛋白，测定蛋白浓度、纯度合格，分别取40μL上样量进行电泳(SDS-PAGE凝胶)，转印(75V、90min)，封闭(10%脱脂奶粉)1h，滴加鼠抗人GLUT-1单克隆抗体(1∶200)、兔抗人GLUT-3多克隆抗体(1∶200)、兔抗人GLUT-4单克隆抗体(1∶200)、兔抗人IRS-1单克隆抗体(1∶200)、IRS-2单克隆抗体(1∶200)、兔抗人PI3K-p85α单克隆抗体(1∶500)、兔抗人SHBG单克隆抗体(1∶200)，采用兔源性β-actin(1∶1 000)为内参照，4℃孵育过夜。洗膜，分别与对应的二抗于室温下孵育2h，并ECL显色，采用自动凝胶成像分析仪(购自北京赛智创业科技有限公司，SG2011)分析各条带灰度值。所有检测操作均有专人负责，且严格按照产品说明书进行。

1.5统计学方法

2 结果

2.1两组孕妇一般资料比较

研究组空腹血糖、OGTT 2h血糖、新生儿体重均显著高于对照组(均P<0.05)，两组其他一般资料相比差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 两组孕妇一般资料比较

2.2两组孕妇胎盘组织中GLUT、IRS、SHBG mRNA表达比较

与对照组相比，研究组孕妇胎盘组织中GLUT-3、GLUT-4、IRS-2、P13K-p85α、SHBG mRNA水平表达显著降低(均P<0.05)，而研究组孕妇胎盘组织中IRS-1、GLUT-1 mRNA水平表达较对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

表2 两组孕妇胎盘组织中GLUT、IRS、SHBG mRNA表达比较

2.3两组孕妇胎盘组织中GLUT、IRS、SHBG蛋白表达比较

与对照组相比，研究组孕妇胎盘组织中GLUT-3、GLUT-4、IRS-1、SHBG蛋白水平表达显著降低(均P<0.05)，而研究组孕妇胎盘组织中P13K-p85α、IRS-2、GLUT-1蛋白水平表达较对照组相比差异无统计学意义(均P>0.05)，见表3，两组孕妇的蛋白电泳条见图1。

表3 两组孕妇胎盘组织中GLUT、IRS、SHBG蛋白表达比较

注：1～5正常对照组，6～10GDM组。

2.4两组孕妇胎盘组织中GLUT、IRS、SHBG mRNA水平表达相关性分析

经过Pearson分析结果显示：SHBG与GLUT-3、GLUT-4、IRS-2、P13K-p85αmRNA水平表达呈显著正相关性(r值分别为2.081、4.842、3.660、3.492，均P<0.05)；IRS-2与GLUT-1、GLUT-4 mRNA水平表达呈显著正相关性(r值分别为4.033、2.841，均P<0.05)；IRS-1与GLUT-3、P13K-p85αmRNA水平表达呈显著负相关性(r值分别为-5.124、-3.556，均P<0.05)。

2.5两组孕妇胎盘组织中GLUT、IRS、SHBG蛋白水平表达相关性分析

经过Pearson分析结果显示：SHBG与GLUT-3、GLUT-4、IRS-2蛋白水平表达呈显著正相关性(r值分别为4.337、2.734、4.625，均P<0.05)；IRS-2与GLUT-1、GLUT-4蛋白水平表达呈显著正相关性(r值分别为4.851、4.508，均P<0.05)；IRS-1与GLUT-3蛋白水平表达呈显著负相关性(r=-4.667，P<0.05)。

3讨论

3.1妊娠糖尿病发病机制

探寻GDM的发病机制，进行早期诊断以及进行针对性的预防和治疗对保护母婴健康至关重要[6]。目前临床研究普遍认为GDM发病机制主要与胰岛素抵抗相关，而胰岛素转导通路的异常改变能够直接引发胰岛素抵抗。当体内胰岛素结合α亚基受体后，诱发β亚基络氨酸残基自身磷酸化，并使IRS-1、IRS-2络氨酸残基磷酸化，从而与下游效应分子调节单位P13K-p85α相结合，激活下游效应因子P13K调节GLUT，GLUT失调可影响机体糖代谢平衡，由此可见胰岛素信号转导途径的任何一个环节发生异常改变都可直接影响胰岛素的生物效应[7]。

3.2胎盘组织中GLUT、IRS、SHBG的作用

GLUT是一类葡萄糖转运蛋白家族，作为载体蛋白转运单糖来维持机体内的葡萄糖稳态，也是孕妇与胎儿之间葡萄糖转运的载体蛋白，是胰岛素信号转导途径的最终步骤。研究报道孕妇胎盘组织中主要存在GLUT-1、GLUT-3、GLUT-4[8]。其中GLUT-1的含量最多而且分布较广，其负责转运母体循环和胎盘之间的葡萄糖，是孕妇与胎儿之间葡萄糖转运的最主要的分子。GLUT-3的含量较少且呈散在分布，负责将葡萄糖从胎盘血池转运至脐静脉。GLUT-4的含量虽然最少，但却在胰岛素信号转导途径中起着关键性作用，该分子负责胎盘绒毛中的葡萄糖代谢，而胰岛素可促使其加快转运速率，当GLUT-4表达降低则胰岛素敏感性随之下降，进而发生胰岛素抵抗[9-10]。因此，胎盘中GLUT表达异常可能与葡萄糖转运异常以及胰岛素抵抗息息相关。此次研究结果也证实研究组孕妇胎盘组织中GLUT-3、GLUT-4 mRNA以及蛋白水平表达较对照组而言均显著降低(P<0.05)，说明GDM与孕妇胎盘组织中GLUT的表达水平具有一定的相关性。

IRS在胰岛素转导通路中主要作用是作为胰岛素受体和P13K-p85α相连接的递质，当IRS与胰岛素受体结合能力下降时，胰岛素受体信号转导受到影响，从而引发胰岛素抵抗。此次研究结果显示，研究组孕妇胎盘组织中IRS-1蛋白较对照组而言显著降低(P<0.05)，呈低表达。与王丽娜等[11]的研究结果相符，证实孕妇胎盘组织中IRS-1的含量与GDM具有明显相关性。

SHBG是由肝脏产生的一种运输性激素的载体蛋白，调控人体内性激素水平，可随着胰岛素水平的上升而下降，与胰岛素抵抗密切相关，在GDM孕妇血清中呈低表达，故而也可将其用来预测GDM的发生和进展[12]。而近年来研究发现GDM孕妇的胎盘组织中也有SHBG表达存在[13]。本次研究结果显示，研究组孕妇胎盘组织中SHBG mRNA以及蛋白水平表达较对照组而言均有显著降低(P<0.05)，提示GDM孕妇胎盘组织中SHBG水平表达明显下调。

3.3胎盘组织中GLUT、IRS、SHBG的相关性

本次研究Pearson分析结果显示，SHBG与GLUT-3、GLUT-4、IRS-2、P13K-p85αmRNA水平表达呈显著正相关性(P<0.05)，IRS-2与GLUT-1、GLUT-4 mRNA水平表达呈显著正相关性(P<0.05)，IRS-1与GLUT-3、P13K-p85αmRNA水平表达呈显著负相关性(P<0.05)。另外，SHBG与GLUT-3、GLUT-4、IRS-2蛋白水平表达呈显著正相关性(P<0.05)，IRS-2与GLUT-1、GLUT-4蛋白水平表达呈显著正相关性(P<0.05)，IRS-1与GLUT-3蛋白水平表达呈显著负相关性(P<0.05)，以上结果提示GLUT-4 mRNA以及蛋白水平降低与胰岛素抵抗的程度具有相关性，且IRS-2在胰岛素信号转导过程中发挥较大的作用。此次研究与以往研究结果相符[14]。

综上所述，GDM患者的GLUT、IRS、SHBG mRNA及蛋白水平表达显著降低，且三者之间具有相关性。