禽源沙门氏菌快速检测方法研究进展*

方焕新 李智丽 黄淑坚 何 诚 袁 生

(1. 佛山科学技术学院生命与生物工程学院，佛山 528231)(2. 中国农业大学动物医学院，北京 100193)

沙门氏菌病是由沙门氏菌(Salmonella)引起人和各种温血动物的一种人畜共患病，临床上分为伤寒、副伤寒、胃肠炎和败血症四种主要症候群。在细菌性食物中毒报告病例中，沙门氏菌毒常列榜首，其中，重要的人兽共患病原菌包括：鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、乙型副伤寒沙门氏菌(S.para-typhiB)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、德尔俾沙门氏菌(S.derby)、海德堡沙门氏菌(S.heidelberg)、婴儿沙门氏菌(S.infantis)。

沙门氏菌具有血清型多、宿主分布广泛，临床上存在难以防治、难以净化等“卡脖子”技术问题，长期依赖抗菌素治疗引发的抗菌素耐药性和抗菌素残留，也严重威胁着畜禽健康养殖和人类健康。

1 沙门氏菌的诊断方法进展

1.1 细菌培养和鉴定标准

传统的细菌培养法作为法定的检测技术手段，需要7 d检测时间，我国国标采用对所有样品进行增菌后检测，与加拿大健康保护分支(Health Protection Branch，HPB)、美国食品药物管理局细菌学分析手册(Food & Drug Adimnistration，FDA/Bacteriological Analytical Manua，BAM)、官方分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)、美国农业部食品安全检验局(Food Safety and Inspection Service of United States Department of Agriculture，USDA/FSIS)和国际标准化组织(International Organization for Standards，ISO)等国家或国际组织推荐增菌样品方法一致。国家标准GB 4789.4—2016《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》与美国、加拿大和国际组织的检测区别点见表1所列。

1.2 沙门氏菌传统的抗原分型诊断

血清型鉴定依据考夫曼-怀特血清表，结合生化试验、玻片凝集试验鉴定多聚糖菌体(O)抗原、荚膜抗原(Vi)和鞭毛(H)抗原[1]，划分为A～Z 和 O51～O63、O65～O67共 42 个O 群，58 种 O 抗原和63 种 H 抗原[2]。

1.3 玻片凝集法检测抗体

以鸡白痢标准株(O-1、9、123)和变异株(O-1、9、122)制备多价抗原，可以检测鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌[3]。但大肠杆菌、链球菌、微球菌等具有相同抗原，鸡白痢假阳性率达到40%[4]。如何减少玻片凝集法存在的缺陷问题，是目前亟待解决的技术难题之一。

表1 沙门氏菌不同检测方法的区别点Table 1 Detecting assays for Salmonella diagnosis

1.4 免疫胶体金技术检测抗体

利用原核表达系统获得invA重组蛋白，纯化后作为诊断标记物,将其包被在硝酸纤维素膜，结合胶体金免疫显示技术， 制备成鸡白痢沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条。因过高的敏感性而导致的假阳性过高是其不足，需要进一步优化条件[5]。

1.5 磁柱吸附法

磁珠上包被能够特异性识别沙门氏菌表面蛋白的抗体进行快速、富集沙门氏菌，利用含有沙门氏菌生长的营养成分、选择剂以及特异酶显色底物的微生物测试片，对微生物进行双重筛选，提高沙门氏菌检测的特异性[6]。24 h内可完成检测，不需要大型设备，大大降低了检测成本。该方法缺陷是定性检测，无法分型检测。

1.6 ELISA法检测抗原和抗体

ELISA方法具有快速、特异性和大批量检测样品，检测灵敏度可达1×105～1×106CFU/mL[7]。以肠炎沙门氏菌血清型特异单抗制备ELISA法，与国标法符合率为97.14%[8]。以肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的O抗原建立ELISA检测抗体法，出现3%～30%的交叉反应[9]。鸡白痢脂多糖和保守蛋白作为包被抗原，ELISA法敏感性和特异性高于玻片凝集试验、琼脂扩散试验。焦新安等[10]利用O9抗原的单克隆抗体，建立了抗体竞争ELISA。陈小玲等[11]利用沙门氏菌菌毛保守蛋白fimY, 建立了间接fimY-ELISA方法，其敏感性优于平板凝集试验，但是特异性低于脂多糖-ELISA。以SpiC蛋白建立间接ELISA，可以区分感染和免疫鸡白痢疫苗鸡群[12]。

1.7 分子生物学诊断技术进展

沙门氏菌属特异性基因包括吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白基因(invA)、 I 型菌毛基因(fimA)、肠毒素基因(stn)、侵袭调节蛋白基因(hilA)、H1相抗原基因(fliC)、毒性质粒相关毒力基因(spv)、LPS O 抗原rfb基因、组氨酸转运操纵子基因(hut)、外膜蛋白基因(opmC)、16S rRNA基因和16S-23S rDNA 之间的区域基因，16S-23S rDNA被作为PCR 检测属特异引物的靶基因[13-14]。

1.7.1PCR检测技术：根据国内流行的B、C1、D和E1群，建立基于O和H抗原多重PCR鉴定方法，可以检测肠炎、鼠伤寒、鸡白痢、鸡伤寒等589种沙门氏菌血清型[15]。利用InvJ基因设计的多重PCR，对肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等7种沙门氏菌种特异性鉴定[16]。

1.7.2叠氮溴化丙锭-脱氧胆酸钠-微滴数字PCR(SD-PMA-ddPCR)检测技术： 其原理是样品进行微滴化处理，经PCR扩增后，有荧光信号的微滴判读为1，无荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。SD-PMA-ddPCR技术能成功检测活菌核酸，避免死菌对检测结果的干扰，这对监测食品污染的活菌具有鉴别诊断用途[17]。

1.7.3交叉引物等温扩增法：以沙门氏菌肠侵袭蛋白invA基因特异保守序列，设计交叉引物等温扩增探针序列，检测低限为 10 CFU/mL。优点是可大量、快速检测，不能用于分型鉴定[18]。

1.7.4基因芯片技术：设计鞭毛H1、H2和体细胞O抗原寡核苷酸探针，标记生物素制成SalmonellaGenoSerotyping Array(SGSA)微阵列芯片，最低细菌检测限为860 CFU/mL，可检测出112种血清型[19-20]。国际上三种商品化的基因芯片检测盒分别为：Salm Sero-Genotyping As-1 kit[21]，Check & Trace(Check-Points)[22]以及xMAP Salmonella serotyping assay(xMAP)[23]。4种方法的优点和缺点见表2所列。

表2 基因芯片法检测技术的比较Table 2 Comparison among different gene-chip kits

1.7.5CRISPR-SeroSeq： CRISPR位点是细菌基因组中进化最快的基因元件之一，并且具有包含细菌所特有的生物学的多态性[26]。通过对CRISPR位点的扩增和测序，然后利用CRISPR finder对间隔序列的比对分析，进而完成对单一样品的不同沙门氏菌血清型检测可检测蒙德维的亚、肯塔基、肠炎、鼠伤寒沙门氏菌等菌株。所提及的检测方法的优缺点比较结果见表3所列。

表3 不同沙门氏杆菌检测方法优点和缺陷Table 3 Advantages and disadvantages of different assays

目前存在沙门氏菌血清型众多，单一的诊断方法难以实现快速诊断，以高敏感性和特异性鉴别不同血清型。高通量基因芯片法存在依靠荧光阅读设备，检测成本高，无法直接在临床应用，难以大量推广的技术困境。CRISPR-SeroSeq有望缩短检测时间，实现高敏感性和特异性的有机结合，区分不同血清型，尚需要相关深入的研究，建立成熟的技术平台，开发一系列诊断试剂盒。

2 针对SPF鸡群的沙门氏菌检测方法

SPF鸡群作为目前最常用的实验动物之一，沙门氏菌列为19种必检项目之一。按照国标GB/T 17999.1—2008推荐3种方法检测：血清平板凝集试验、病原分离和试管凝集试验。针对SPF鼠沙门氏菌检测，以菌种分类gyrB基因为诊断靶点，优化扩增条件并建库，利用 Illumina 高通量测序技术对样本进行测序和序列分析，能够检测出样本中极微量的沙门氏菌，检测限可达0～100 CFU/mL。该检测方法具备稳定性好、灵敏度高的特点[27]。选取invA基因作为 LAMP 法检测靶点基因，设计4～6条引物，检测限为33.6 CFU/mL，适用于树鼩粪便样品的检测[28]。因此，高通量测序技术、LAMP方法适用于其他实验动物(如鸡、大鼠、豚鼠、兔等)沙门氏菌的检测。

3 展望

沙门氏菌污染对养殖业、SPF动物、食品安全等方面存在重大威胁，开发更加快速、鉴别诊断试剂盒势在必行，提高沙门氏菌的检测效率，保证畜禽养殖和人类健康至关重要。

利用传统的细菌培养法，并结合生化实验和玻片凝集实验来鉴定分型，所消耗的时间往往贻误了及时发现解决问题的时机，而且面对如此多的血清型，这种鉴定方法往往会出现错误诊断。未来沙门氏菌检测技术必须符合如下条件：①现场检测，可视化判定，缩短检测时间；②价格合理，养殖企业可以普遍接受，以达到大面积的技术推广；③具备区分不同属特异性和鉴别不同的血清型；④区分不同的致病性和动物宿主来源，实现动物溯源可追踪性。杜绝沙门氏杆菌从食品动物向消费者侵害，确保食品安全的最后一道防线，保证消费者的健康。

总之，开发敏感、特异性、便捷、快速的新型沙门氏杆菌试剂盒，既可以实现控制国内沙门氏菌向外扩散和人畜共患感染，也可以防止从境外向国内输入性感染，可以为畜禽养殖提供技术保证，为食品安全和人类健康提供技术支撑。