自发性先天性白内障大鼠皮肤移植及生化位点的研究*

尤金炜 董 敏 吴正林 梁 磊 田小芸

(东部战区总医院医疗保障中心实验动物室，南京 210002)

本单位于2007年在屏障环境SD大鼠生产的仔鼠中发现5只先天性白内障大鼠，3只雄性，2只雌性。以此大鼠为基代，培育近交系大鼠，经过10多年的连续近交繁殖，现已培育至第31代，暂定名为TSC大鼠，理论上已经达到基因高度纯合，符合近交系动物的近亲繁殖代数要求。我们已经对TSC大鼠各生理指标做了相应的检测与分析，包括：晶状体的病理学研究、繁殖性能及生长发育试验、生化及血流变学指标、脏器质量及系数以及血压与体温基础数据分析[1-6]，为了观察 TSC大鼠的基因纯合度和遗传稳定性，根据国家标准[7]我们对其进行了背-背皮肤移植实验以及酯酶-1、酯酶-3等11个生化标记基因的测定。

1 材料与方法

1.1 实验动物

皮肤移植实验：TSC大鼠10只，6～8周龄，体质量170～200 g，雄性。

生化标记位点检测：TSC大鼠6只，6～8周龄，体质量200～220 g，雌雄各半，选自基础群F29代的同一窝群。

所有动物均由本实验室提供，实验动物生产许可证号：SCXK(军)2017-0018，动物均在SPF级设施饲养，实验动物许可证号：SYXK(军)2017-0037，并按使用的3R原则给予人道的关怀。其他对照品系购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。

1.2 主要仪器与试剂

仪器：电泳仪为Bio-Rad Model 3000Xi，醋酸纤维膜和醋酸纤维板为浙江台州生产；手术器材一套。

试剂：Tris(Sigma)、HCl(上海久忆化学试剂有限公司)等均为国产分析纯；0.9%生理盐水(浙江济民制药股份有限公司)；青霉素G钠粉80万单位(山东鲁抗医药股份有限公司)；0.7%戊巴比妥钠溶液(南京安培化工科技有限公司)；5%聚维酮碘溶液(东部战区总医院)。

1.3 方法

1.3.1皮肤移植实验：0.7%戊巴比妥钠溶液按1 mL/200 g腹腔注射麻醉大鼠，大鼠背部朝上固定，背部左右各剃毛一块，左侧用于自体皮肤移植，右侧用于异体皮肤移植；5%聚维酮碘溶液消毒，取皮约8～10 mm，放入装有生理盐水的平皿中，除去真皮以外的筋膜和脂肪等，第1只鼠先行自体皮肤移植，后取右侧用于异体移植，移植顺序按1号鼠移植给2号鼠，2号鼠移植给3号鼠，以此类推，10号鼠移植给1号鼠，每片皮片均逆毛移植。用结节缝合法将皮片缝合4针，5%聚维酮碘溶液消毒，10%青霉素钠溶液抗菌，贴上创可贴后压上消毒纱布并固定，见图1～图3，术后单笼饲养并记录。

图1 白内障大鼠的异体皮片缝合Fig.1 Suture of allogenric skin graft in cataract rats

图2 创可贴贴于白内障大鼠的手术创面Fig.2 A band-aid applied to the surgicalwound of cataract rats

图3 纱布贴压于白内障大鼠移植皮片上Fig.3 Gauze was applied to the skin graft of cataract rats

1.3.2生化标记位点检测：制备血浆及溶血素，以抗凝毛细管行眼眶采血术，500×g、5 min，分离血浆和血球，吸出血浆备用。在去除血浆的富含红血球的试管内加入4份蒸馏水，振荡1 min，成为红色透明液体即为溶血素。

组织匀浆上清液：采用安死术处死动物，剖腹，取肾脏1个，小肠6～8 cm，睾丸1个，肺脏1叶。分别加入2份适量预冷蒸馏水，组织匀浆器匀浆。匀浆液置4 ℃低温高速离心机中，2 000×g、30 min，吸取上清液备用。

电泳样品的制备、电泳步骤、染色等都按GB/T 14927.1—2008实验动物近交系小、大鼠生化标记检测法的规定进行操作。

2 结果

2.1 皮肤移植实验

1周后拆除包扎，观察皮片成活情况，若发现皮片干瘪、脱落则为手术失败。如皮片脱痂，手术部位平整、且10 d后长出新毛视为手术成功。本次实验的10只皮肤移植大鼠均移植成活，见图4～图5。

图4 白内障大鼠100 d后自体移植皮片生长情况Fig.4 Growth of autologous skin graft incataract rats after 100 days

图5 白内障大鼠100 d后异体移植皮片的生长情况Fig.5 Growth of allografts skin graft incataract rats after 100 days

2.2 生化标记位点检测

按照中华人民共和国国家标准GB/14923—2010 实验动物 哺乳类实验动物的遗传质量控制、GB/T 14927.1—2008实验动物近交系小、大鼠生化标记检测法测定，TSC大鼠的11个生化标记基因呈单一型的纯合子，未见到杂合子，检测结果见表1所列。中国食品药品检定研究院报告编号：DH201906614R。

表1 TSC大鼠生化标记基因检测结果Table 1 Detection results of biochemicalmarker genes in TSC rats

3 讨论

近交系动物是指同胞兄妹连续交配20代以上而培育出来的遗传上具有高度纯合性和稳定性的纯品系动物[7]。近交系动物基因高度纯合与一致、实验结果精确度高且极易重复，具有可比性，对各种应激反应均一，遗传背景明确，现已被广泛应用于生命科学研究各个方面。大鼠是比较常用的实验动物之一，尤其在生理学、药理学、毒理学和肿瘤学等研究领域。相比近交系小鼠的培育，近交系大鼠培育需要的费用较高，且时间也比较长，目前国内培育近交系大鼠的较少，已知的近交系大鼠有200多种，常用的大约有150多种[8]。

本单位于2007年以5只先天性白内障大鼠为基代，培育近交系大鼠，经过10多年的连续近交繁殖，现已培育至第31代，暂定名为TSC，该大鼠繁殖力正常，晶状体外观以及组织形态学改变均符合白内障病理改变。人类先天性白内障的病因比较复杂，病理机制不完全清楚，且能够跟踪研究的样本较少，此模型大鼠有可能在研究人类发病机制、寻找药物靶点等医学研究方面成为一种有价值的动物模型。大量的研究结果已经证明，近交系动物基因高度纯合，免疫源性高度一致，其同种(系)异体皮肤移植不会发生免疫排斥反应；皮肤移植是近交系动物遗传监测的指标之一。皮肤移植有背-背法移植，尾-尾法移植，耳-背法和尾-背法等方法。本文采用背-背法全厚皮片对自行培育的先天性白内障近交系大鼠进行自体和异体皮肤移植实验，以观察皮片的成活情况。同种(系)异体皮肤移植实验是利用免疫系统能够识别“自己”与“异体”的特性来鉴定组织相容性基因是否一致的重要手段[9-11]，同种(系)异体移植成功说明同种(系)异体的组织相容性一致。本实验采用的白内障大鼠自体和异体皮肤移植均成活100 d及以上，未发生排拆反应，说明自我培育的白内障大鼠的组织相容性是一致的。

生化标记基因位点的测定结果显示，酯酶-1等11个生化标记位点均为纯合型，符合国家近交系质量标准规定，参照目前常用的近交系大鼠品系的生化遗传概貌，未发现与TSC大鼠的生化标记基因位点完全相同的，TSC大鼠具有独特的遗传特征，所测定的遗传概貌可作为该品系大鼠今后遗传质量监测的判定指标。

现代生物技术的高速发展，检测手段和检测仪器的不断更新，实验动物的遗传质量监测已经不局限于传统的生化标记检测、皮肤移植法、毛色基因测试以及下颌骨测量法了[12]。分子生物学技术被广泛的运用到检测中，微卫星标记、SNP标记等DNA标记方法越来越普遍的被用于实验动物的遗传质量检测，其优点是操作简便，重复性好，且仅需要提取少量血液样本即可实现实验动物的遗传质量检测，无需安乐死实验动物，符合动物福利和3R原则，主要应用于近交系动物的遗传分析，但尚未形成标准[13]。皮肤移植法和生化标记检测法自上世纪90年代开始使用至今，在实验动物遗传质量控制方面发挥着至关重要的作用。