七甲川菁染料与醋酸阿比特龙的化合物应用于小鼠前列腺癌的活体成像和治疗研究*

谭邓旭 马帅军 吴朋朋 张彩勤 赵 勇 白 冰 秦 靖 师长宏

(空军军医大学实验动物中心，西安 710032)

前列腺癌是男性泌尿系统最常见的肿瘤之一，全球发病率仅次于肺癌排名第二[1-3]。在北京、上海、广州等经济发达地区，前列腺癌发病率已跃居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤首位[4]。初诊前列腺癌患者大多属于激素依赖性，随着雄激素剥夺治疗和病程进展，几乎都会发展为去势抵抗性前列腺癌[5]。尽管在筛查和治疗局部疾病方面取得了进展，但晚期前列腺癌仍然无法治愈。手术或化学去势等策略在过去60多年一直是前列腺最有效治疗方法[6]，但近几年的研究表明，前列腺癌可能会产生内分泌雄激素，通过AR基因突变和/或扩增的类固醇水平可支持肿瘤的持续生长[7-8]。实际上，去势抵抗性前列腺癌患者在现有治疗方案中预后是有限的，因此迫切需要研发创新药物。

雄激素受体阻滞剂在前列腺癌治疗中表现出的效果[9-11]吸引科学家对新疗法产生浓厚兴趣，目前在临床前和临床研究都集中开发有效的抗雄药物。抗雄激素药CYP17抑制剂——醋酸阿比特龙(abiraterone acetate，ABi)在不同阶段均具有抗雄激素作用，并在临床试验中取得了不错的疗效[12-15]。临床实验发现，醋酸阿比特龙能够显著下调患者tPSA、睾酮水平，改善患者前列腺功能，缓解病情进展。本实验室前期研究发现，七甲川菁近红外荧光染料(IR-783和DZ-1)在肝癌、胃癌等肿瘤的PDX模型中有很好的肿瘤靶向性[16-20]，因此，本研究设计将七甲川菁近红外荧光染料DZ-1和IR-783分别与醋酸阿比特龙进行共轭连接，研究其化合物在前列腺肿瘤的治疗及其在小动物活体成像中的应用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物及环境：5～6周龄SPF级雄性裸鼠30只，体质量22～25 g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2016-0010。饲养于空军军医大学实验教研保障中心实验动物室SPF级屏障设施中，实验动物使用许可证号：SYXK(陕)2018-001。环境温度23～25 ℃，相对湿度40%，12 h/12 h昼夜交替，饲喂江苏协同生物无菌饲料，饮用水经高压灭菌处理，动物自由摄食和饮水。

1.1.2伦理审查及肿瘤标本：本研究动物实验通过第四军医大学实验动物福利及伦理委员会批准，编号：19027。前列腺癌肿瘤标本(编号：B45354)来自空军军医大学西京医院，肿瘤标本的获取经过患者本人及家属同意，并签署知情同意书，仅供实验研究。人体标本实验通过西京医院医学伦理委员会的批准(批准编号：2016317)。

1.1.3试剂及药物：Caliper Lumina Ⅱ小动物光学成像系统(Caliper)；高效液相-电喷雾-离子井/飞行时间串联质谱仪(shimadzu)；UV-1900(岛津国际贸易有限公司)；荧光分光光度计FL8500(PerkinElmer)。

醋酸阿比特龙(Johnson & Johnson)；DZ1-ABi、783-ABi(北京泛博生物化学有限公司化学合成)；异氟烷麻醉剂(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；细胞培养基(Thermo Fisher)；PC-3、 C4-2及LNcaP(ATCC)。

1.2 方法

1.2.1化合物合成:委托北京泛博生物化学有限公司在冰水浴氮气保护条件下加入饱和氢氧化锂(36.64 mg，1.53 mmol，FW=23.95)，室温反应24 h盐酸调节pH 2～3析出醋酸阿比特龙，对七甲川菁染料和醋酸阿比特龙在不同位点进行连接，其产物分别为DZ1-ABi和783-ABi。使用高分辨率质谱对两种产物进行结构表征检测，使用紫外分光光度计和荧光分光光度计检测两种新合成化合物紫外吸收光谱以及荧光光谱。

1.2.2MTT检测药物作用后细胞增殖抑制率:在37 ℃、5%CO2的加湿培养箱中，在10%胎牛的RPMI-1640加入青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 μg/mL)培养人前列腺癌细胞PC-3、 C4-2、LNcaP。收集对数期细胞铺板96孔板，调整细胞浓度为2 000个/孔(边缘孔用无菌PBS填充)，孵育至细胞贴于孔底(96孔平底板)。用完全培养基稀释药物至不同的浓度(160 μmol/L、80 μmol/L、40 μmol/L、20 μmol/L、10 μmol/L、0 μmol/L)，每个浓度设8个重复孔， 100 μL/孔，孵育72 h，倒置显微镜下观察。每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，继续培养3 h。培养结束，小心吸去孔内培养液，加入二甲基亚砜150 μL/孔，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD450 nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

1.2.3实验分组及药物治疗:将人前列腺癌PDX(B45354)皮下移植裸鼠，待瘤组织长至90～120 mm3时，随机分为4组(n=5)：对照组(control)、ABi组、DZ1-ABi组以及783-ABi组，参考ABi的给药方式和剂量[15]，三种药物均按照0.15 mmol/kg灌胃，1次/d，连续30 d。利用游标卡尺测量肿瘤体积，每5天测量一次，分别测量皮下肿瘤的长度(l)和宽度(w)，肿瘤体积(V)，计算公式为：V=1/2×(w2×l)。

1.2.4活体成像监测DZ1-ABi和783-ABi体内代谢分布状况：将前列腺癌细胞PC-3(1×106个/只)皮下移植裸鼠，待肿瘤生长至300～500 mm3分别注射DZ1-ABi和783-ABi(0.1 nmol/只)，通过Caliper Lumina Ⅱ小动物光学成像系统分别监测2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，7个时间点染料在小鼠体内代谢情况，观测肿瘤部位近红外荧光面积和强度(激发/发射：745 nm/ICG)。

2 结果

2.1 化合物的合成与表征

DZ1-ABi和783ABi合成路径如图1A所示。我们分别对新和成两种化合物DZ1-ABi(FM=1 067.8)和783-ABi(FM=1 127.61)进行了质谱检测(图1B)，证实该化合物化学结构。在PBS、5%FBS和DMSO不同溶剂分别测定DZ1-ABi(100 μmol/L)和783-ABi(100 μmol/L)光学特征(图1C)，结果显示，两种化合物在不同溶剂中的吸收峰均在780～800 nm，但是两种化合物在不同溶剂紫外吸收峰值不同，且在同一介质中，DZ1-ABi明显高于783-ABi。两种化合物溶解于PBS(100 μmol/L)进行荧光检测发现DZ1-ABi发射峰值在836 nm，783-ABi仅在813 nm，且同一浓度DZ1-ABi荧光信号明显强于783-ABi，我们将两种染料放置在EP管内用活体成像设备验证了这一结果(图1D)。

图1 DZ1-ABi和783-ABi化合物的合成及其表征检测Fig.1 Synthesis, characterization and detection of DZ1-ABi and 783-ABi compounds

2.2 MTT检测药物作用细胞增殖抑制率

结果如图2所示。通过MTT法检测结果表明：抑制肿瘤细胞增殖对药物剂量有一定依赖性，并且发现药物浓度在20～40 μmol/L时DZ1-ABi 表现出明显的肿瘤抑制作用，抑制效果显著优于783-ABi和ABi。

2.3 药物疗效评价

三种化合物的疗效通过抑制肿瘤的体积大小进行评估，结果显示三种药物相较于对照组都有明显的肿瘤治疗效果，但DZ1-ABi治疗组结果揭示更为显著的肿瘤抑制作用(图2D)。

2.4 动态监测化合物染料的代谢分布

实验结果显示，DZ1-ABi从4 h后开始在肿瘤上聚集，随着时间推移皮下肿瘤部位的荧光特异性逐渐增强，783-ABi始终未能表现肿瘤的特异靶向性，并且在荧光强度上，DZ1-ABi也远高于783-ABi(图3A)。利用ROI计算药物代谢24 h内单位面积肿瘤的荧光强度，DZ1-ABi和783-ABi在统计学上有显著差异(P<0.01)(图3B)。

图2 三种化合药物在细胞模型和PDX模型中的疗效评价注：A.三种化合物对肿瘤细胞PC-3的作用；B. 三种化合物对肿瘤细胞C4-2的作用；C. 三种化合物对肿瘤细胞LNcaP的作用；D. 三种药物抑制PDX(B45354)肿瘤的体积变化Fig.2 Evaluation of the efficacy of three chemical compounds in cell model and PDX modelNote：A. The effect of the 3 compounds on the PC-3 cell; B. The effect of the 3 compounds on C4-2 cell;C. The effect of the 3 compounds on LNcaP cell; D. Three compounds inhibit the volume change of PDX (B45354) tumor

图3 DZ1-ABi和783-ABi在小动物活体成像检测结果注：A.DZ1-ABi和783-ABi在前列腺癌PDX皮下模型中的活体成像；B. 化合物代谢24 h后DZ1-ABi和783-ABi在单位面积的荧光强度对比Fig.3 DZ1-ABi and 783-ABi in the live imagingNote: A. Living imaging results of DZ1-ABi and 783-ABi on PDX subcutaneous model of prostate cancer;B. Comparison of fluorescence intensity per unit area of DZ1-ABi and 783-ABi after 24 hours of compound metabolism

3 讨论

根治性前列腺切除仍然是治疗前列腺最有效的手段，但在高风险或转移性患者中优先考虑放射疗法、化学疗法和雄激素剥夺疗法[21-24]。近年来，越来越多的研究集中在开发新型多功能药物上，这些药物可以同时实现癌症诊断和个性化治疗[25]。醋酸阿比特龙是一种CYP17抑制剂，可改善接受或不接受多西他赛治疗的前列腺癌患者的总体生存率[26]。除可以抑制CYP17外，醋酸阿比特龙也是雄激素受体的拮抗剂，可以抑制3β-羟基类固醇脱氢酶[27-28]，对表达高水平雄激素受体并合成自身雄激素的前列腺癌有抗肿瘤作用[29]。

本研究将醋酸阿比特龙和七甲川菁近红外荧光染料在不同位点进行连接获得两种化合物DZ1-ABi和783-ABi，使用高分辨率质谱和紫外分光光度计对其进行结构表征检测，证实其化学结构的准确性且具有荧光属性。MTT结果显示，DZ1-ABi对肿瘤细胞的抑制作用显著优于783-ABi和ABi。为了证实DZ1-ABi的肿瘤抑制效果，我们在动物体内选择更具有异质性并且更接近临床样本的前列腺PDX模型(B45354)进行药效实验。结果同体外细胞实验结果一致，实验结果表明DZ1-ABi化合物在前列腺癌治疗中的潜力。小动物活体成像检测结果更清楚地研究新合成的两种具有近红外荧光属性化合物的体内代谢和分布情况，我们设计了给药2～72 h的连续活体成像监测，DZ1-ABi从4 h开始在肿瘤部位的特异性富集可持续至72 h，其对前列腺癌成像的高特异性在前列腺癌患者的早期诊断、转移灶筛查等具有一定的临床应用前景。

化合物在结构上表现出不同位点的链接，其化学光学特性不尽相同，因此通过以上研究，不论是在体外细胞水平还是体内动物实验结果，DZ1-ABi均表现出显著的抑制肿瘤的优势，同时兼具了七甲川菁近红外荧光染料的成像诊断功能和醋酸阿比特龙的治疗作用，是具有前列腺癌成像和治疗双重功能的新型药物，且显示出作为理想的化疗药物可同时实现肿瘤诊断成像的巨大潜力。本实验室将通过更多的前列腺癌PDX模型进一步验证研究DZ1-ABi的诊断和治疗效果。