甘草泻心汤联合血竭抗大鼠溃疡性结肠炎复发的效果及对IL-6、TNF-α的影响 *

李 敏，刘 肖，徐小波，李天然

(川北医学院附属医院肛肠科， 四川 南充637000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种难治性消化道疾病，以黏液脓血便、腹泻、腹痛、里急后重及不同程度的肠外并发症为主要临床表现[1-2]，具有病程长、反复发作、迁延难愈的特点。UC的患病率逐年上升，每千人中有1～2人患病[3]，已成为全球性的疾病[4]。UC是导致相关性结直肠癌发生的危险因素之一[5]。由于长期慢性炎症及溃疡的刺激，UC患者患结直肠癌的风险是正常人群的5倍[6]。UC的发病与遗传、免疫、环境及上皮屏障缺陷等因素有关[7]，细胞因子在UC的免疫反应和局部炎症反应中起重要作用。白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是参与UC炎症级联反应的主要细胞因子，能促进白细胞活化，使肠道黏膜炎症反应持续[8-9]。目前，UC难以被彻底治愈，维持治疗和防止UC复发是医生和患者面临的问题。氨基水杨酸、皮质类固醇和免疫抑制剂是治疗UC的主要化学药物，但长期用药不良反应多，治疗费用高，部分患者疗效不理想[10]。研究表明，甘草泻心汤能明显缓解UC患者临床症状，降低患者血清炎症细胞因子水平，促进肠道屏障功能修复[11-12]。 中药血竭灌胃能明显减轻UC模型大鼠结肠黏膜的病理损害，降低大鼠血清炎症因子TNF-α的表达[13]。本研究进一步探讨甘草泻心汤联合血竭对硫酸葡聚糖钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的UC模型大鼠的疗效、抗复发作用，以及对血清IL-6和TNF-α的影响，为甘草泻心汤联合血竭防治UC的合理使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

无特定病原体(specified pathoger free,SPF)级(Sprague-Dauley,SD)大鼠100只，雌雄各半，体质量(180±20)g，由川北医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK(川)2018-18，动物使用许可证号为SYXK(川)2018-076。

1.2 药品、试剂与仪器

甘草泻心汤组成：炙甘草12 g，黄连3 g，黄芩9 g，半夏9 g，干姜9 g，大枣6 g，人参9 g。药材由川北医学院附属医院药剂科提供，按原方比例将饮片以常规煎煮法煎液，浓缩为含生药2.4 g/mL溶液备用。龙血竭胶囊，云南云河药业有限公司产品，产品批号150408，0.3g/粒。取胶囊内粉末，用浓缩甲基纤维素钠与甘草泻心汤药液配制成含血竭0.15 g/mL生药的混悬液备用。柳氮磺吡啶片(salazosulfapyridine,SASP)，上海信谊天平药业有限公司产品，产品批号09161007，0.25g/片。将SASP研成粉末，用浓缩甲基纤维素钠与生理盐水配制成每毫升含0.17 g生药的混悬液备用。硫酸葡聚糖钠(DSS)40 000，上海西宝生物科技有限公司产品，编号OS1701A；大鼠TNF-α ELISA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司产品，编号ml002859-J；大鼠IL-6试剂盒， 上海酶联生物科技有限公司产品,编号ml102828-J。BMJ-Ⅲ型石蜡包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪，均为常州市中威电子仪器有限公司产品；RM2125RTS切片机，德国LEICA公司产品；D3024R型低温高速离心机，美国Beckman Coulter公司产品；酶标仪，美国Bio Rad公司产品；GZX-GF-MBS-2型电热恒温培养箱，上海跃进医疗有限公司产品。

1.3 模型的建立与给药

将SD大鼠100只按随机数字表法分为空白对照组10只和造模组90只，造模组大鼠按照文献[14]方法，采用3 g/L DSS自由饮用7 d制作大鼠UC模型。将造模成功的90只大鼠随机分为模型对照组、甘草泻心汤+血竭组、柳氮磺胺吡啶组各30只。根据《中药药理研究方法学》[15]中动物给药量，甘草泻心汤+血竭组每天给予甘草泻心汤 6 mg/g、血竭375 μg/g混悬液灌胃，柳氮磺吡啶组每天给予柳氮磺吡啶450 μg/g混悬液灌胃，空白对照组、模型对照组每天给予等体积生理盐水2.5 mL/只灌胃，1 d 1次，连续灌胃7d 。

1.4 检测指标

末次灌胃结束后24 h,随机抽取空白对照组大鼠5只处死，并处死模型对照组和药物组每组10只大鼠，取血及结肠组织。按照参考文献[16-18]对大鼠进行疾病活动指数(disease activity index,DAI)、结肠黏膜损伤(colon mucosa damage index,CMDI)及病理组织学(histopathological,HS)评分，评分标准见表1～3。此外，采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清IL-6、TNF-α水平。

表1 DAI评分标准

剩余大鼠如前法继续灌胃14 d，然后除空白对照组外，余各组在第3周灌胃的同时再次给予3 g/L DSS 溶液自由饮用7 d，以复制成UC复发型模型。二次造模结束后，立即处死所有大鼠，如前法再次对大鼠进行DAI、CMDI及HS评分，检测大鼠血清IL-6、TNF-α水平。

表2 CMDI评分标准

表3 HS评分标准

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 灌胃7 d后各组大鼠DAI 、CMDI及HS评分对比

灌胃7 d后，模型对照组DAI 、CMDI及HS 评分高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。甘草泻心汤+血竭组和柳氮磺吡啶组DAI 、CMDI及HS 评分低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。甘草泻心汤+血竭组HS评分低于柳氮磺吡啶组，差异有统计学意义(P<0.05)；甘草泻心汤+血竭组与柳氮磺吡啶组DAI及CMDI评分对比，差异无统计学意义(P﹥0.05)。见表4。各组大鼠结肠组织苏木素-伊红(HE)染色后病理改变见图1。

表4 灌胃7 d后各组大鼠DAI、CMDI及HS评分对比

A.空白对照组：肠黏膜完好，上皮细胞排列整齐，腺体规则，杯状细胞充足 B.模型对照组：肠黏膜损坏，隐窝和杯状细胞大面积丢失，腺体排列紊乱，隐窝基底层较多炎细胞浸润 C.柳氮磺吡啶组：杯状细胞和隐窝少许修复，较多腺体增生，隐窝基底层明显炎细胞浸润 D.甘草泻心汤+血竭组：杯状细胞和隐窝明显修复，较多腺体增生，隐窝基底层少许炎细胞浸润

2.2 灌胃7 d后各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平对比

模型对照组大鼠血清IL-6、TNF-α水平高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。甘草泻心汤+血竭组和柳氮磺吡啶组IL-6、TNF-α水平低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。甘草泻心汤+血竭组IL-6、TNF-α水平低于柳氮磺吡啶组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 灌胃7 d后各组大鼠血清IL-6及TNF-α水平对比

2.3 二次造模后各组大鼠DAI 、CMDI及HS评分对比

模型对照组和柳氮磺吡啶组各有2只大鼠在二次造模第3天死亡，解剖后发现均有泌尿系统水肿及失血。二次造模后模型对照组DAI 、CMDI及HS 评分高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。甘草泻心汤+血竭组和柳氮磺吡啶组DAI 、CMDI及HS 评分低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。甘草泻心汤+血竭组HS 评分低于柳氮磺吡啶组，差异有统计学意义(P<0.05)；甘草泻心汤+血竭组与柳氮磺吡啶组DAI及CMDI评分对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。各组大鼠结肠组织HE染色后病理改变见图2。

表6 二次造模后各组大鼠DAI、CMDI及HS评分对比 分，

A. 空白对照组：黏膜完整，上皮细胞排列整齐，腺体规则，隐窝和杯状细胞充足 B. 模型对照组：黏膜上皮损坏，溃疡明显，隐窝和杯状细胞严重丢失，黏膜增厚、水肿，黏膜肌层较多炎细胞浸润 C.柳氮磺吡啶组：黏膜少许瘢痕组织，隐窝和杯状细胞大面积丢失，隐窝基底层明显炎细胞浸润 D.甘草泻心汤+血竭组：黏膜少许瘢痕组织，杯状细胞和隐窝少许丢失，隐窝基底层少许炎细胞浸润

2.4 二次造模后各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平

模型对照组大鼠血清IL-6、TNF-α水平高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；柳氮磺吡啶组和甘草泻心汤+血竭组IL-6、TNF-α水平低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；甘草泻心汤+血竭组IL-6、TNF-α水平低于柳氮磺吡啶组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表7。

表7 二次造模后各组大鼠血清IL-6及TNF-α水平对比

3 讨 论

溃疡性结肠炎是慢性非特异性炎症性肠病的一种，主要病理表现为结肠黏膜损伤，病变常累及黏膜和黏膜下层，发病的中心环节是机体的异常免疫反应导致的肠黏膜屏障功能损坏及炎症反应[19-20]。随着环境影响和经济的发展,溃疡性结肠炎的发病率在我国逐年增高[21],且病程超过30年的癌变率可高达30%[22]，已被世界卫生组织列为现代难治病之一。研究表明，一位溃疡性结肠炎患者每年的花费在926.49～6 583.17美元之间，且经济付出与治疗回报常不成正比[23]，长期用药的不良反应和高昂的费用降低了患者的生活质量和满意度。西医学治疗UC只能缓解症状[24]，而越来越多的中医药被研究证实对UC具有良好的抗炎、抗肿瘤和免疫调节等作用并被广泛用于UC的治疗。 根据溃疡性结肠炎反复发作的痛、泻、黏液脓血便的主要临床表现，中医学认为脾虚为其发病之本，湿邪为其致病之标，血瘀为局部病理变化[25]。湿与瘀交结，蕴于肠间，寒热错杂，导致UC经久不愈，每因感受外邪、饮食不当、劳累、情志变化时诱发，益气健脾、除湿化瘀是缓解其发作，也是防止复发的关键[26]。甘草泻心汤由甘草、半夏、黄芩、黄连、干姜、大枣、党参组成，补、清结合，是治疗湿阻中焦、脾胃虚弱、寒热错杂的经典方，有黏膜修复剂之称，具有抗溃疡、调节黏膜分泌和机体免疫功能的作用，能促进UC肠道屏障功能修复[11-12]。中药血竭能散瘀定痛，止血生肌，可改善局部血液瘀滞状态，调节免疫，促进结肠黏膜溃疡愈合[13]。甘草泻心汤联合血竭紧扣UC患者湿伏血瘀、脾胃虚弱的病机特点，既能健脾益气，除肠间之湿；又能行内瘀之血，使内伏湿瘀得除，消除致病之因和病理产物，从而达到治疗和防止UC复发的作用。

IL-6和TNF-α是重要的促炎症细胞因子。IL-6 能诱导细胞因子的表达，使TNF-α的生物学活性增强，炎症反应加重，其在血清中的水平可反映UC的严重程度[22]。TNF-α能激活上皮细胞，诱导趋化因子，使中性粒细胞聚集，炎症效应放大，损伤肠黏膜组织，其在血清中的水平与UC严重程度呈正相关[27]。本研究表明，第1次造模后，大鼠倦怠，厌食，腹泻，便血，体质量减轻；结肠黏膜充血、水肿，肠腔管壁增厚粘连，肠黏膜腺体排列紊乱，上皮损坏及溃疡形成，隐窝和杯状细胞大面积丢失，隐窝基底层较多炎症细胞浸润。甘草泻心汤+血竭组和柳氮磺吡啶组大鼠经相应药物灌胃后，大鼠活动量及进食量增加，大便逐渐成形并转为颗粒状，便血消失，体质量增加，肠黏膜充血、水肿、糜烂减轻；杯状细胞和隐窝有不同程度的修复，较多腺体增生，炎性细胞浸润减少。第2次造模后模型对照组大鼠大便质地更稀，便血量增多；结肠黏膜上皮损坏加重，溃疡增多，结肠与周围组织粘连明显，隐窝和杯状细胞严重丢失，黏膜肌层较多炎症细胞浸润。甘草泻心汤+血竭组和柳氮磺吡啶组大鼠的大便质地不同程度变软，再次出现便血；肠黏膜充血、水肿，并有糜烂，新生溃疡下面有少许瘢痕组织，隐窝和杯状细胞少许丢失，隐窝基底层可见炎症细胞浸润。灌胃7 d和二次造模后模型对照组DAI、CMDI、HS 评分及血清TNF-α、IL-6水平明显高于空白对照组(P<0.05)；甘草泻心汤+血竭组和柳氮磺吡啶组DAI、CMDI、HS 评分及血清TNF-α、IL-6水平较模型对照组显著降低(P<0.05)；甘草泻心汤+血竭组HS 评分及血清TNF-α、IL-6水平较柳氮磺吡啶组低(P<0.05)。结果表明，甘草泻心汤+血竭能消除UC模型大鼠的症状，促进损伤的肠黏膜炎症消退并修复，改善结肠黏膜的病理损害，促进溃疡愈合、抑制UC大鼠血清TNF-α、IL-6的表达。

综上所述，甘草泻心汤联合血竭灌胃能改善DSS诱导的UC模型大鼠腹泻及黏液血便的症状，降低UC大鼠结肠DAI、CMDI及HS 评分，抑制UC大鼠血清TNF-α、IL-6的表达，具有明确的抗溃疡性结肠炎复发作用。