理肺消积丸对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长的抑制作用*

刘素晓，何慧慧，贾 瑞，杜 娟，林珊珊，刘卫红，李 亚

(1.河南中医药大学第一附属医院中心实验室，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学基础医学院，河南 郑州 450046)

肺癌全称为原发性支气管肺癌，起源于支气管黏膜上皮及肺泡，是导致全球人类死亡的第一大恶性肿瘤，目前多以放射治疗、化学治疗及靶向治疗为主要手段，但其副作用大，治疗费用高昂，患者生活质量得不到保障[1-2]。中医药治疗恶性肿瘤具有独特的优势，但对古代经典方剂的筛选、挖掘和应用还有待深入研究。近年来，中医药治疗恶性肿瘤处于辅助治疗地位，在增强患者免疫力、减少放射治疗和化学治疗的毒副反应、提高生活质量等方面具有较好的疗效和优势[3-4]。目前，中医治疗肺癌多以“扶正为本，祛邪为标，标本兼治”为原则，常用祛邪法有化痰逐瘀、清热解毒、消积攻坚等[5-6]。本团队通过对古代典籍的查阅和筛选，发现《备急千金要方·肺脏积气》中的系列方剂多与今之治疗理念不同，多用温热药、寒热并用、通补兼施。理肺消积丸正是基于此系列方药所拟定的方剂，由人参、制乌头、大黄、紫菀、前胡、细辛等组成，具有扶正祛邪、消积散结、攻积逐滞、消痰化痞功效[7]。其临床疗效和相关作用机制目前尚不明确，仍需进一步深入研究。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)基因编码的蛋白兼具脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，是第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。因此，调控PTEN蛋白的表达可作为治疗癌症的途径之一[8]。本研究以Lewis肺癌小鼠模型为研究对象，观察理肺消积丸对肿瘤细胞增殖、凋亡和PTEN蛋白等的影响，以期为其临床应用提供理论基础和依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

6～8周龄健康的无特定病原体(specified pathogen free,SPF)级雄性C57BL/6小鼠50只，体质量18～22 g，购自郑州市华兴实验动物养殖场[动物生产许可证号为SCXK(豫)2019-0002]，饲养于河南中医药大学第一附属医院中心实验室SPF级动物房[动物使用许可证号为SYXK(豫)2017-0001]。

1.2 细 胞

标记有荧光素酶的Lewis肺癌细胞株(Lewis-luciferase,Lewis-luc)由天津市肺癌研究所提供。

1.3 药品、试剂与仪器

理肺消积丸由人参、制乌头、大黄、紫菀、前胡、细辛等组成，由河南中医药大学药学院制剂实验室按质量标准鉴定并制备成小蜜丸，约0.158 g/丸。使用时与水混悬，按小鼠与人的等效剂量(10丸/d)换算每日小鼠灌胃量。顺铂注射液，齐鲁制药有限公司产品，产品批号EA1A9004B。DMEM高糖培养基(产品批号12100-500)、胰蛋白酶(产品批号T1300)、苏木素-伊红染色试剂盒(产品批号G1120)，均为北京索莱宝科技有限公司产品；胎牛血清，Gibco公司产品，产品批号16000-044；荧光素底物，Promega公司产品，产品批号P1041；细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗体(产品批号10205-2-AP)、PTEN抗体(产品批号10047-1-AP)，均为武汉三鹰生物技术有限公司产品；TUNEL试剂，武汉博士德生物工程有限公司产品，产品批号MK1017。IVIS Lumina Series 3型小动物活体成像系统，PerkinElmer公司产品；CK40型显微镜，奥林巴斯公司产品。

1.4 动物分组、模型的建立与给药

按随机数字表法将小鼠分为空白对照组、模型对照组、理肺消积丸组、顺铂组和联合组5组，每组10只。采用皮下接种法建立肺癌小鼠模型：将培养于DMEM高糖培养基(含体积分数100 mL/L胎牛血清)中的Lewis-luc细胞以胰蛋白酶消化、计数，用生理盐水制备为1×107个/mL的细胞悬液。除空白对照外的其余4组均将上述细胞悬液接种于C57BL/6小鼠右腋部皮下，接种量为0.2 mL/只，接种后将小鼠放回饲养笼继续饲养；空白对照组以相同方法皮下接种生理盐水。接种1 d 后，对各组小鼠进行以下干预。联合组：接种Lewis-luc细胞，给予理肺消积丸240 μg/(g·d)灌胃+腹腔注射顺铂0.5 μg/(g·d)。理肺消积丸组：给予理肺消积丸240 μg/(g·d)灌胃+腹腔注射等体积生理盐水。顺铂组：给予等体积生理盐水灌胃+腹腔注射顺铂0.5 μg/(g·d)。模型对照组：给予等体积生理盐水灌胃+腹腔注射。空白对照组：给予等体积生理盐水灌胃+腹腔注射。灌胃及腹腔注射1 d 1次，持续14 d。

1.5 检测指标

1.5.1 一般情况

模型制备后每隔2天固定时间观察小鼠皮毛色泽、精神、饮食、活动等。

1.5.2 肿瘤生长情况

末次给药24 h后，采用小动物活体成像系统观察小鼠体内肿瘤生长情况。以戊巴比妥钠50 μg/g体质量麻醉小鼠，腹腔注射荧光素底物125 μg/g体质量，10 min后，检测荧光信号强度，拍照，并采用Image-Pro Plus 6.0软件分析积分光密度值。

1.5.3 肿瘤组织病理形态学情况

取小鼠肿瘤组织，以40 g/L 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，并制备4 μm厚的切片，苏木素-伊红染色，显微镜下观察肿瘤组织形态学改变情况。

1.5.4 肿瘤细胞增殖情况

取小鼠肿瘤组织，以质量分数为40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，并制备4 μm厚的切片。采用免疫组化法对肿瘤组织PCNA蛋白的表达情况进行检测；显微镜下观察组织阳性染色情况，并采用Image-Pro Plus 6.0软件分析阳性细胞占比情况。

1.5.5 肿瘤细胞凋亡情况

取肿瘤组织，常规制备石蜡切片，脱蜡，水合，PBS洗涤，加入TUNEL染色液，封片处理，光学显微镜下观察计数，并拍照。计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.5.6 肿瘤组织抑癌蛋白PTEN的表达

采用免疫组化法对肿瘤组织PTEN蛋白的表达情况进行检测。操作方法同1.5.4。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组一般情况对比

空白对照组小鼠毛色光亮、精神饱满、饮食充足。模型对照组小鼠出现毛色晦暗、形体消瘦、精神倦怠、活动减少、食量及饮水量减少等表现。各药物组小鼠皮毛光泽度、活动量、饮食量及精神状态等有所改善，其中以理肺消积丸组的效果较为明显。

2.2 各组小鼠肿瘤生长情况对比

模型对照组小鼠体内荧光信号增强，肿瘤增殖明显。与模型对照组对比，理肺消积丸组、顺铂组和联合组小鼠体内荧光信号明显减弱，肿瘤生长受到显著抑制，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠体内荧光信号积分光密度值对比

2.3 各组小鼠肿瘤组织病理学对比

模型对照组小鼠肿瘤细胞排列紧密，呈弥漫分布，异型性明显，胞浆丰富，核大深染，核分裂象多见。理肺消积丸组、顺铂组及联合组小鼠肿瘤细胞排列不规则，出现细胞空泡化、坏死情况，核分裂象减少。见图1。

图1 各组小鼠肿瘤组织病理学对比(HE染色，×200)

2.4 各组小鼠肿瘤细胞增殖情况对比

模型对照组小鼠肿瘤组织PCNA蛋白表达程度高，阳性细胞比例80%以上。与模型对照组对比，理肺消积丸组、顺铂组和联合组的PCNA蛋白表达程度均下降，阳性细胞占比明显降低(P<0.05)。见图2和表2。

表2 各组小鼠肿瘤组织PCNA蛋白表达阳性细胞占比对比

图2 各组小鼠肿瘤组织PCNA蛋白表达对比(免疫组化染色，×200)

2.5 各组小鼠肿瘤细胞凋亡情况对比

模型对照组小鼠肿瘤细胞凋亡率低。与模型对照组对比，理肺消积丸组、顺铂组和联合组的细胞凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3和表3。

表3 各组小鼠肿瘤细胞凋亡率对比

图3 各组小鼠肿瘤细胞凋亡情况对比(TUNEL染色，×200)

2.6 各组小鼠肿瘤细胞PTEN蛋白表达对比

模型对照组小鼠肿瘤细胞PTEN蛋白表达量极低。与模型对照组对比，理肺消积丸组小鼠肿瘤细胞PTEN蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；而顺铂组和联合组小鼠肿瘤细胞PTEN蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。与理肺消积丸组对比，顺铂组和联合组小鼠肿瘤细胞PTEN蛋白表达量显著下降(P<0.05)。见图4和表4。

表4 各组小鼠肿瘤组织PTEN蛋白表达阳性细胞占比对比

图4 各组小鼠肿瘤组织PTEN蛋白表达对比(免疫组化染色，×200)

3 讨 论

中医学中并无肺癌之病名，据临床症状可将其归属于“肺积”“息贲”“息积”“积气”等范畴。因肺主一身之气，故将积气列于肺脏，多因正气亏损、脏腑失和、气滞血瘀、饮食痰浊所致。内伤七情、饮食不节等均可导致气机失司，酿生痰瘀，热痰壅结而生癌毒，胶结成块，而成肺积[9-11]。因此，治疗应以扶正祛邪、清肺消积为主。理肺消积丸方中人参可扶正；制乌头、大黄一热一寒，通阳散寒；紫菀、前胡降气止咳，燥湿化痰，消积排脓；细辛散寒逐饮，止痛镇咳。全方共奏扶正祛邪、消痰化痞、化癥消积之效，用于治疗肺积之证。本研究结果表明，理肺消积丸可明显抑制小鼠体内肿瘤生长，改善肺癌小鼠身体及精神状况。

肿瘤细胞无限增殖及凋亡率的持续下降是肿瘤快速生长的细胞机制。PCNA为增殖核抗原，存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞，通常用来指示肿瘤细胞的增殖状态[12]。本实验结果表明，理肺消积丸和顺铂的干预可明显降低模型小鼠肿瘤细胞PCNA的表达；同时，理肺消积丸和顺铂可以显著促进模型小鼠肿瘤细胞的凋亡。PTEN是癌症中最常失活的抑癌基因之一，其在多种癌症中表达均降低[13]。PTEN蛋白可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性，抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡而发挥抑癌作用[14]。本研究表明，模型对照组小鼠肿瘤细胞PTEN蛋白阳性表达率极低，理肺消积丸的干预治疗可明显提高PTEN的表达水平，而顺铂的干预并没有使PTEN的表达水平得到明显提高，这可能是由于顺铂通过抑制细胞DNA的复制过程而非提高PTEN蛋白的表达而发挥抑癌作用。

临床上，采用中西医结合的方法治疗肺癌已经成为一种趋势，且有相当一部分已经取得了较好的疗效[3]；但中医往往处于辅助治疗的地位，主要针对西医治疗的毒副作用进行治疗。本研究中，笔者设计了理肺消积丸与顺铂的联合干预组，但并没有观察到理肺消积丸对顺铂疗效有协同作用，产生这种现象的具体原因还尚不清楚，其机制仍需进一步研究。此结果提示，临床中须谨慎或禁止理肺消积丸与顺铂类药物的联合应用。

综上所述，理肺消积丸可显著抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤的生长，其机制可能与其抑制肺癌细胞增殖、上调肿瘤细胞凋亡和PTEN蛋白表达有关，其临床疗效和作用机制还有待于进一步验证和深入研究。