五味子多糖对卵巢癌SKOV3细胞增殖、自噬及内质网应激凋亡的影响

苗昊，杨建立，张松青，燕喃

吉林市中心医院妇科三疗区，吉林吉林 132001

卵巢癌在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率为第3 位，病死率却高居首位，中国人群每年卵巢癌新发病例为52 971 例，且逐年增加，每年死亡达30 886例[1]。卵巢癌早期临床症状不明显，发现时多为晚期，目前多以手术、 化学治疗为主，但效果并不理想，因此，寻找有效抑制卵巢癌发生及发展药物是目前亟待解决的问题。

最新研究发现，五味子多糖对肿瘤细胞有明显的抑制作用，但其具体抗癌机制尚未完全清楚[2]。肿瘤细胞长期在缺氧情况下仍能疯狂生长，抑制内质网应激凋亡，促进肿瘤细胞自噬便是其生存能力极强的重要因素[3]。该研究拟培养卵巢癌SKOV3 细胞并与不同剂量五味子多糖共同培养，探讨五味子多糖对卵巢癌SKOV3 细胞增殖、自噬及内质网应激凋亡的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与分组

在10%灭活胎牛血清的MEM 培养液中加入SKOV3 细胞(37 ℃、5% CO2饱和湿度培养)，待细胞长至瓶底80%左右，用0.25%胰酶消化后留取对数生长期细胞作为该研究的实验细胞。将细胞分为对照组（正常培养 SKOV3 细胞）、五味子多糖组（SKOV3 细胞+分别加入 2.5、5、10 μg/L 五味子多糖进行培养 72 h）。

1.2 检测各组细胞增殖抑制率

在96 孔板中加入高、中、低剂量组SKOV3 细胞100 μg，在每孔内加入 10 μg 的 CCK-8 试剂，置入培养箱（37 ℃ 5% CO2饱和湿度培养）内培养 1～3 d，每组设6 个复孔，培养4 h 后酶标仪调定波长为450 nm进行检测。

1.3 TUNEL 法检测各组卵巢癌SKOV3 细胞凋亡情况

将各组培养72 h 卵巢癌SKOV3 细胞在无菌条件下从培养基吸出，经过0.1% Trition X-100 透化后，加入 3%H2O2200 μL，漂洗 3 次×5 min，加入蛋白酶K 工作静置20 min，再次漂洗后加入TUNEL 反应液，于 37 ℃恒温箱中避光孵育 1 h；PBS 清洗 3 次后加入DAPI，应用PBS 再次漂洗3 次，最后封片剂封片。显微镜下观察细胞，绿色为凋亡细胞，蓝色为存活细胞，凋亡指数计算：凋亡指数（AI）＝各视野阳性细胞数/视野所有细胞总数×100.00%。

1.4 Western blot 检测内质网应激及自噬标记蛋白表达

提取培养72 h 成对数生长的SKOV3 细胞并进行蛋白测定，制备细胞蛋白样本后各抽取50 μg 加入10%的SDS-PAGE 电泳中，干法转膜90 min 后，将加入到5%脱脂牛奶中封闭2 h，再加入anti-GRP78（1：800）、anti-CHOP（1∶1 000）、anti-Beclin-1（1:800）、anti- LC3Ⅰ（1:1 000）及 anti-LC3Ⅱ（1:1 000），4℃孵育6 h，TBST 漂洗后，加入二抗 anti-rabbit（1∶1 000）温孵育2 h，ECL 化学发光显像。

1.5 统计方法

采用SPSS 17.0 统计学软件分析数据，计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SKOV3 细胞的增殖抑制率

与对照组相比，五味子多糖组（2.5、5、10 μg/L）培养24 h、48 h 及72 h 时增殖抑制率升高，且呈剂量依赖型，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组SKOV3 细胞的增殖抑制率对比（±s）

表1 各组SKOV3 细胞的增殖抑制率对比（±s）

组别 剂量（μg/L）五味子多糖组(n=6)增殖率抑制（%）24 h 48 h 72 h 10 5 2.5对照组(n=6)F 值P 值27.58±3.64 17.94±2.29 7.68±1.37 3.46±0.11 26.33＜0.01 34.16±3.48 25.57±2.63 13.29±2.06 3.94±0.74 33.45＜0.01 44.49±4.31 31.68±3.31 22.81±2.63 4.15±0.58 38.75＜0.01

2.2 细胞凋亡结果

TUNEL 结果显示，与对照组 AI（4.55±0.68）相比，五味子多糖低剂量组（12.01±1.48）、中剂量组（19.82±2.55）、高剂量组（26.38±3.24）细胞 AI 指数均明显升高，且AI 随剂量的增高而增高，差异有统计学意义（F=26.49，P＜0.05）。

2.3 卵巢癌 SKOV3 细胞 GRP78、CHOP、Beclin-1、LC3Ⅰ及LC3Ⅱ的表达

与对照组相比，五味子多糖组 （2.5、5、10 μg/L）GRP78、CHOP 表达及 LC3Ⅰ/ LC3Ⅱ值升高，Beclin-1表达降低，且呈剂量依赖型，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表2。

图1 五味子多糖对 SKOV3 细胞 GRP78、CHOP、Beclin-1、 LC3Ⅰ及LC3Ⅱ影响电泳图

表2 五味子多糖对SKOV3 细胞GRP78、CHOP、Beclin-1 及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的影响（±s）

表2 五味子多糖对SKOV3 细胞GRP78、CHOP、Beclin-1 及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的影响（±s）

组别 剂量（μg/L）GRP78CHOP Beclin-1 LC3Ⅰ/LC3Ⅱ五味子多糖组(n=6)2.5 5 10对照组(n=6)F 值P 值0.29±0.03 0.38±0.02 0.49±0.05 0.76±0.08 9.63<0.01 0.36±0.07 0.41±0.06 0.61±0.06 0.93±0.12 11.24<0.01 1.53±0.11 1.32±0.16 1.13±0.09 0.96±0.07 15.62<0.01 1.26±0.09 1.53±0.24 2.09±0.33 2.64±0.27 24.75<0.01

3 讨论

五味子多糖是中药五味子的提取物之一，具有多重生物学作用，已有研究证实，五味子多糖可有效抑制SKOV3 细胞增殖，当五味子多糖体外培养10 μg/L时，SKOV3 细胞增殖抑制率为42%，并通过线粒体途径促使凋亡[4]。该该研究通过CCk-8 法亦得出五味子多糖可明显抑制SKOV3 细胞增殖，五味子多糖体外培养 10 μg/L 时，SKOV3 细胞增殖抑制率为 （44.49±4.31）%。结果基本相同对照组凋亡 AI 仅为 （4.55±0.68），而五味子多糖10 μg/L，在该研究后续的实验中证实，五味子多糖可明显促进SKOV3 细胞凋亡，经TUNLE 染色，对组 AI 高达（26.38±3.24）。该研究与其他研究不同之处在于，该次对各组细胞进行了内质网应激凋亡标志物GRP78CHOP 及细胞自噬标记物Beclin-1、 LC3Ⅰ及LC3Ⅱ蛋白进行检测。

内质网应激是真核细胞均有的保护性机制，GRP78 蛋白可分解内质网中累积的错误折叠蛋白或未折叠蛋白，使其重新折叠为细胞所需蛋白，当内质网应激超过一定强度时，则可能激活CHOP 蛋白，直接诱导细胞凋亡，同时提高细胞自噬激活程度，促进自噬体包裹损伤的内质网及错误折叠蛋白质，使其降解为可用物质，重新进行细胞增殖[5-6]。LC3 是目前研究认为对自噬特异性高的蛋白分子，当自噬发生时，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化，激活细胞自噬系统[7-8]。Beclin-l也是自噬标志蛋白，其与Vps34 形成复合体，促使磷脂酰肌醇磷酸化，从而诱导细胞发生自噬[9]。

既往有学者[10]研究五味子多糖诱导SKOV3 细胞凋亡机制，仅对凋亡标志蛋白Caspase-3 及Bcl-2/Bax 进行检测，研究并不深入，该研究则从内质网应激及自噬角度说明五味子多糖有效抑制SKOV3 细胞增殖的具体机制。该研究结果显示，SKOV3 细胞自身GRP78、CHOP、Beclin-1、 LC3Ⅰ及 LC3Ⅱ均存在一定表达量，说明卵巢癌SKOV3 细胞在正常培养下，仍可发生一定程度的内质网应激凋亡及自噬，而当SKOV3 细胞培养过程中，添加五味子多糖后，GRP78、CHOP 蛋白表达增加，说明五味子多糖可使SKOV3 细胞内质网应激凋亡程度加重； 与此同时，Beclin-1 蛋白表达减少，并且LC3Ⅰ/ LC3Ⅱ值升高，LC3Ⅰ减少向LC3Ⅱ转化，说明五味子多糖与SKOV3细胞共同培养，可抑制肿瘤细胞自噬程度。由上述实验结果推断，五味子多糖可能通过抑制肿瘤细胞自噬，减少对存在未折叠蛋白内质网的分解，进而加重内质网自噬程度，引发内质网应激凋亡，从而抑制卵巢癌SKOV3 细胞增殖。

综上所述，五味子多糖可能通过抑制卵巢癌SKOV3 细胞自噬，增强内质网应激凋亡敏感性，从而起到抑制SKOV3 细胞增殖的作用。五味子多糖有可能成为未来临床治疗卵巢癌的辅助用药，减少卵巢癌患者复发程度。