黄精多糖对H2O2诱导HT22细胞氧化损伤的保护作用

★张玉琴 刘垚君 王欣垚 徐伟 褚克丹 林羽（福建中医药大学药学院 福州 350122）

缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型，发生在大脑中的动脉被血凝块阻塞时，具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点，已成为全球严重危害人类健康的重大疾病之一［1］。缺血性脑卒中涉及的机制复杂多样，其中研究认为，自由基过多产生的氧化应激损伤是其主要的致病机制［2］。组织缺血缺氧后会产生大量的自由基，神经组织内氧化和氧化防御机制失衡进一步损伤神经功能，因此降低脑组织中缺血区氧化应激损伤、维持体内氧化还原平衡也是有效治疗途径。

黄精是我国的传统中药，已有2 000多年的用药历史。黄精富含黄精多糖、甾体皂苷、蒽醌类等成分，现代药理学表明，黄精具有调节免疫，提高学习、记忆能力，抗氧化、延缓衰老、延长寿命、抗疲劳、保护心血管系统、保护肝脏、降血糖、调血脂、抗肿瘤、治疗骨质疏松、改善造血功能等多种药理作用［3］。近年来研究发现，黄精多糖具有显著缓解脑缺血再灌注损伤的作用[4-6]，但其具体作用机制还不是很清楚。本研究利用过氧化氢（H2O2）刺激HT22 细胞，建立体外神经细胞氧化损伤模型，研究黄精多糖对HT22 细胞的保护作用，阐明其抗氧化损伤的作用机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 主要试剂与仪器 黄精多糖（陕西慈缘生物技术有限公司，纯度98 %）；海马神经元HT22 细胞株（北京北纳创联生物技术研究所）；胎牛血清、1640 培养基、0.25 %胰蛋白酶购自美国Gibco 公司；CellTiter 96® AQueous One Solution（美 国Promega公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒（南京建成生物工程研究所），Bax、Bcl-2抗体、β-actin 抗体（Cell Signaling Technology 公司）；Leica 倒置荧光显微镜（德国莱卡相机股份有限公司）；Infinite M200 Pro 型酶标仪( 瑞士Tecan公司) ；ChemiDocXRS +型凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad 公司）。

2 实验方法

2.1 HT22细胞的培养 细胞于含有10 %胎牛血清的1640培养基中，置于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞，0.25 % 胰蛋白酶消化传代培养，进行后续实验研究。

2.2 细胞活性的检测 取培养对数期HT22 细胞，胰酶消化，制备单细胞悬液，计数并接种细胞2.5×104个/mL于96孔板。分别设空白对照组、模型组及药物组，空白对照组和模型组加入含1 %FBS的培养基，药物组分别加入含100、200、400µg/mL的1 % FBS的培养基，培养24 h后，空白组加入100 µL1 % FBS的培养基，其余各组分别加入含H2O2（终浓度为100 µM）的1 % FBS的培养基，培养24 h后每孔中加入CellTiter 96® AQueous One Solution溶液20 μL，继续孵育2 h，终止培养，于490 nm波长下测定各孔光吸收值（OD值），计算细胞活性。重复实验3次。各组设定为6个复孔。细胞活性=给药组OD值/对照组OD值100 %。

2.3 细胞形态的观察及SOD活性、MDA、GSH含量的检测 取培养对数期HT22 细胞，胰酶消化，制备单细胞悬液，计数并接种细胞于6 孔板。分别设空白对照组、模型组及药物组，空白对照组和模型组加入含1 % FBS的培养基，药物组分别加入含100、200、400 µg / mL的1 % FBS的培养基，培养24 h后，空白组加入1 % FBS的培养基，其余各组分别加入含H2O2（终浓度为100 µM）的1 % FBS的培养基，培养24 h后用相差显微镜观察并拍摄细胞形态，并收集上清液及细胞，按照试剂盒说明书步骤检测其中SOD活性，MDA 及GSH含量。

2.4 凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Nrf2蛋白表达水平的检测 取培养对数期HT22 细胞，胰酶消化，制备单细胞悬液，计数并接种细胞于6 孔板。分别设空白对照组、模型组及药物组，空白对照组和模型组加入含1 % FBS的培养基，药物组分别加入含100、200、400 µg/mL的1 % FBS的培养基，培养24 h后，空白组加入1 % FBS的培养基，其余各组分别加入含H2O2（终浓度为100 µM）的1 % FBS的培养基，培养24 h后弃去上清液、收集细胞。取细胞加适量裂解缓冲液，于冰上匀浆裂解30 min，4 ℃，12 000 g/min，离心，取上清，取适量蛋白上样，经 SDS-PAGE 电泳分离，电转至固相支持体 PVDF膜上，分别按程序加入一抗（Bax、Bcl-2）和二抗，化学发光后，成像。应用分析软件对杂交蛋白区带进行积分光密度值比较分析。

2.5 统计学分析 实验数据结果均以 表示，用SPSS 20.0 软件进行多组间单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 黄精多糖对HT22细胞活性的影响 与空白组相比，H2O2诱导HT22细胞氧化损伤后，细胞活性显著降低（P＜0.01）。黄精多糖干预后，与模型组相比，细胞活性显著提高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图1。

图1 黄精多糖对HT22细胞活性的影响

3.2 黄精多糖对细胞形态变化的影响 倒置荧光显微镜观察，空白组细胞形态完整，多呈多边形。模型组细胞经H2O2损伤后，细胞形态发生显著变化，细胞变圆，细胞密度降低，细胞核皱缩，贴壁不牢。与模型组相比，黄精多糖干预组明显改善细胞形态，细胞形态有伸展的梭形，细胞密度增加。见图2。

图2 黄精多糖对HT22细胞形态变化的影响

3.3 黄精多糖对SOD活性、MDA、GSH含量的影响 与空白组相比，模型组SOD活力和GSH含量显著降低，MDA含量显著升高（P＜0.01）；而黄精多糖干预后，与模型组相比，细胞中SOD活力和GSH含量均升高，MDA 含量显著降低（P＜0. 05或P＜0.01）。见图3。

图3 黄精多糖对SOD活性、MDA、GSH含量的影响

3.4 黄精多糖对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Nrf 2蛋白表达水平的影响 与空白组相比，模型组Bcl-2、Nrf2蛋白相对表达减弱，Bax蛋白相对表达增强，具有明显的统计学差异（P＜0.01）。与模型组相比，黄精多糖组Bcl-2、Nrf2蛋白相对表达升高，Bax蛋白相对表达减弱，且均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。见图4。

图4 黄精多糖对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Nrf2蛋白表达水平的影响

4 讨论

缺血性脑卒中是由于大动脉或其分支血管阻塞导致脑血流中断而发生的破坏性脑血管事件［7］，脑缺血时，损伤部位会产生大量的自由基，体内的氧化和抗氧化作用失衡，引起神经元水肿和坏死，造成神经元氧化应激损伤，导致继发性损伤。因此，抗氧化应激损伤被认为是缺血性脑卒中治疗的重要措施之一。

黄精被誉为“芝草之精”，主要含有多糖、低聚糖、甾体皂苷、黄酮、蒽醌类化合物、氨基酸和微量元素等成分，近年来对黄精的研究逐渐增多并不断深入，研究发现其活性成分黄精多糖对急/慢性脑缺血再灌注后神经元的损伤有保护作用[4-8]。本研究以H2O2对神经元细胞系HT22 细胞造成损伤，建立缺血性脑卒中离体模型，以黄精多糖作用H2O2损伤后的HT22细胞，细胞活性及形态观察结果表明黄精多糖可以提高H2O2损伤后的HT22细胞活性，减少细胞损伤。进一步实验观察到，黄精多糖可有效下调Bax、上调Bcl-2蛋白的表达水平。这些结果提示黄精多糖对H2O2损伤的HT22细胞具有保护作用。

机体组织中的内源性抗氧化物(如GSH、SOD等)和脂质氧化产物MDA 常作为机体氧化应激状态的检测指标［9］。本研究结果显示, 黄精多糖能明显降低MDA 含量，提高GSH含量、SOD活性，可有效发挥抗氧化作用。核因子 NF-E2 相关因子（nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2）是机体内氧化应激重要的调控因子，可以发挥转录因子的作用，上调相关抗氧化基因的表达［10］，且已有研究表明升高Nrf2的表达可以发挥脑缺血损伤的保护作用［11］。本研究发现, 黄精多糖可上调Nrf2蛋白的表达，提示黄精多糖发挥抗氧化作用可能是通过上调Nrf2通路实现的。

综上所述，本研究发现黄精多糖能通过增强细胞内抗氧化酶活性，保护细胞对抗氧化损伤，其作用机制与Nrf2通路有关。