绒毛染色体检测应用于稽留流产原因探讨中的价值分析

陈雪芹，冯媛

云南省曲靖市第一人民医院妇科，云南曲靖 655000

通常情况下，自然流产主要指妊娠＜28 周、胎儿体 重＜1 kg，妊娠存在流产情况；其中妊娠在12 周内终止为早期流产[1]。 根据相关临床统计显示，自然流产的发生率为15%～40%， 而其中80%以上为发生在12 周内的早期流产[2]。 稽留流产的别名为过期流产，其主要指胚胎已死亡滞留在宫腔中，并且没有有效排出，是自然流产的一种特殊类型。 引起稽留流产的因素繁多，主要因素包括遗传因素、免疫相关因素、感染因素以及分娩环境和产妇心理因素等。 因此明确流产的具体原因并采取有效的干预措施具有重要意义，已有的研究表明，染色体异常是其中一个很重要的原因， 约有60%稽留流产为胚胎染色体异常引起， 而精确检测流产组织核型，有利于寻找胚胎停育病因，从而将有助于寻找到流产发生的根源所在， 并通过对再次妊娠流产风险的预测，为后续的干预和治疗提供重要的参考依据[3]。 研究对象为2018 年10 月—2020 年2 月于该院住院行流产术的孕早期稽留流产患者154 例，收集相关研究数据，对稽留流产患者的绒毛染色体及其危险因素进行了研究，为后续指导提供重要参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象为方便选取于该院住院行流产术的孕早期稽留流产患者154 例，最低年龄16 岁，最高年龄43岁，胚胎停育孕周介于孕5～15 周之间。 纳入标准:①全部患者均为稽留流产；②均有停经史或尿hCG 阳性,在流产前对产妇进行相关检查发现胎儿已经停止发育；③均为知情自愿参加该次研究。 该研究通过该院伦理委员会批准。 排除标准:①孕期存在感染患者；②具有激素类药物使用史患者；③具有有害物质接触史患者；④具有内分泌疾病史患者。

1.2 方法

首先需要严格遵守无菌操作原则， 对患者实施清宫术，术后收集绒毛组织，剂量为10～20 mg，对其进行冲洗，共冲洗两次，使用生理盐水冲洗，连同母体血3 mL(EDTA 抗凝)，之后实施二代高通量测序。 基因组DNA提取使用德国QIA-GEN 公司生产的基因组DNA 提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行。 使用高通量测序文库进行试剂盒完成CNV 文库构建， 构建完成的文库使用美国KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒对文库进行准确定量。 并且需要结合各个样本文库的浓度实施混合处理，将完场混合的文库应用于高通量测序仪平台上，展开全面测序工作，同时需要合理设置参数，其中最小精度=100 Kb，测序深度=1 X。 对于需要进行测定的相关序列，合理应用RUPA 软件，将其与人类基因组进行高效匹配。 在这一环节，将人类基因组进行合理划分，为多个区域，统计各个区域内样本完全匹配的序列个数，结合研究所得结果对比值进行合理计算， 并通过特定算法明确样本的拷贝数变异(CNVs)区域，进而明确待测定样本染色体的实际情况。 之后需要对相应标准化Z值进行全面分析， 通过Z 值对染色体异常情况加以明确。 之后进行数据分析工作， 需要搜索基因变异数据库、在线人类孟德尔遗传数据库等相关数据，明确CNV临床价值。

1.3 观察指标

对染色体检测异常情况进行分析。将＜35 岁组和≥35 岁组绒毛染色体异常率进行比较。

1.4 统计方法

采用SPSS 19.0 统计学软件对数据进行分析, 计量资料以（）表示，组间比较采用t 检验；计数资料以频数和百分率（%）表示，组间比较采用 χ2检验。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标本获取情况

共收集患者绒毛标本154 例，对全部患者实施DNA提取，高通量测序得到全部结果，检测成功率为100%。

2.2 染色体检测异常情况

154 例稽留流产患者绒毛组织中， 染色体异常89例，检出率100%，其中60 例为数目异常，表现为非整倍体数目异常，3 例为双色体，1 例为15 和18 三体异常共存。29 例为结构异常。孕妇年龄≥35 岁组和＜35 岁组的绒毛染色体异常率分别为75.71%（53/70）和30.95%（26/84）,组间对比，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表 1。

表1 两组绒毛染色体异常率比较[n(%)]

2.3 染色体微缺失、微重复分析

微重复 3 例，为 10.34%（3/29）；微缺失 2 例（6.89%）。

3 讨论

稽留流产的原因具有一定的复杂性， 导致其发生的最主要因素便是染色体发生异常[4]，对染色体异常的进行划分， 主要分为数目方面的异常和结构方面的异常， 数目异常的主要类型为整倍体的变化和非整倍体变化，其中后者十分常见，发生风险较大[5]。 结构异常的主要类型分为缺失、重复等。 上述变化都会引发一些遗传性反应，进而致使变异个体表型出现明显变化，严重可能引发死亡[6]。

常规G 显带核型正常细胞中也存在变异的情况，主要为亚显微结构的严重变异， 其主要内容为染色体的微缺失、微重复以及类型丰富的染色体DNA 拷贝数（Genomic copy number wariations, CNVs）[7]。 基因组中约有一部分变异为CNVs，绝大部分的CNVs 属于良性，但是剩余的一小部分便是引发严重染色体病症的重要因素。 CNVs 多因为干扰基因表达进而对妊娠造成不良影响，流产的风险非常高。 CNVs 的可能致病机制较多，主要为剂量效应及位置效应两方面、 致使部分隐性致病基因暴露出来、形成新的融合基因，对妊娠造成严重的影响[8]。

稽留流产的主要原因是绒毛染色体异常， 两者之间息息相关。 因此对临床来说，全面检测绒毛染色体具有重要的意义， 有助于临床医师及时了解流产的主要因素，有助于为后续妊娠提供重要的指导依据，价值明显[9]。 下面该文对详细方法进行概述:①如果结果存在明显异常， 下一次妊娠则需要明确科学合理的产前诊断方法。 ②如果结果显示正常或者染色体具有多态性，需要实施其他检测，急需查明原因。 ③如果检测结果显示致病性具有未执行，需要对夫妇实施外周血检测，明确其是否为遗传因素影响所致。如果CNVs 通过健康父母遗传，那么便不是染色体因素引发的流产，如果 CNVs 通过携带者双亲进行遗传， 可通过辅助生育技术进行明确，如果为新发型，可能是主要致病因素，需要进行详细咨询，通过专业临床医师对家族史、遗传史进行全面分析，了解CNVs 再发风险，为下次妊娠作正确指导[10]。

该文研究了154 例流产样本的拷贝数变异以非整倍体改变为主。 根据该次研究结果可知，154 例稽留流产患者绒毛组织中，染色体异常89 例，检出率100%，其中60 例为数目异常，表现为非整倍体数目异常，3 例为双色体，一例为15 和18 三体异常共存。29 例为结构异常。 孕妇年龄≥35 岁组和＜35 岁组的绒毛染色体异常率分别为 75.71%（53/70） 和 30.95%（26/84）（P＜0.05）。 宋杰[11]等对61 例孕早期稽留流产绒毛应用高通量测序技术染色体检测研究结果显示， 孕妇年龄≥35岁组和＜35 岁组的绒毛染色体异常率分别为76.9%和51.4%，与该文研究结果一致。

基于对流产绒毛进行核型的全面分析， 该方法有助于对染色体异常情况进行检测， 但是该方法对绒毛细胞的采样具有较高的要求，培养成功率低，分辨率也低，难以得到满意的结果[12]。近年来，临床测序技术呈飞速发展的趋势，进步明显，高通量的基因测序技术开始得到广泛应用，其处理数据量非常大，一次能够对几十万到几百万个DNA 分子测定。 目前已从常规基础科研实验室的应用转入临床医学的应用， 该项目将高通量基因测序技术用于稽留流产妇女绒毛染色体检测，为临床提供大样本量的研究， 旨在为稽留流产的病因学研究积累数据，为指导妇女再生育提供遗传学的依据。

综上所述， 染色体异常是早期稽留流产的重要因素，高龄孕产会导致胚胎染色体异常发生率提高。 采取高通量测序技术效果确切， 有助于了解稽留流产的原因，为下一次良好妊娠提供有效指导。