一珠二化合物组合化学法合成喹唑啉酮类化学库及其抗肺癌活性的初步筛选

王 琼，郑锦鸿，王锦芝，刘瑞武

(1.汕头大学医学院化学教研室，广东 汕头 515041；2.加州大学戴维斯分校生物化学和分子医药系，加利福尼亚 戴维斯 95817)

近年来小分子酪氨酸激酶抑制剂等分子靶向抑癌药物的应用，为提高非小细胞肺癌患者远期生存率提供了广阔的研究平台，然而酪氨酸激酶抑制剂疗效维持时间短，获得性耐药不尽人意。但其共有的喹唑啉骨架药效活性片段已在抗癌药物的研发中不断被成功应用。喹唑啉酮是喹唑啉的一类衍生物，也是多种生物碱和药物的骨架。现有抗肿瘤活性的药物多为4-喹唑啉酮结构[1-2]，如具有4(3H)-喹唑啉酮结构片段的抗叶酸剂雷替曲塞、含有三唑并喹唑啉酮结构片段的酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂[3-4]，但存在耐药及毒性等缺点。

组合化学产生于20世纪80年代，其主要特点是在较短时间内得到大量具有分子多样性的化合物，能够与高通量筛选相结合，加快新药研发的过程，在先导化合物的发现及结构优化中发挥重要作用。近年来，Lam 等[5-7]改善一珠一化合物法创立了一珠二化合物(one-bead two-compound，OBTC)法，OBTC 法作为高通量合成的主体，将更为简便、准确和高效地寻找作用细胞表面的功能分子[8-9]。本研究采用OBTC 组合化学法，以氨基树脂为固相载体，四功能分子骨架N-Alloc-3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸为模板，依据生物电子等排和骨架跃迁原理，保留喹唑啉N2位与表皮生长因子受体Gln767 羰基的潜在氢键作用，主要改变N3为酮基，考察经水分子桥联与Thr766形成氢键的作用；同时考虑到活性位点内部的大疏水口袋可容纳多样性的基团，进一步于喹唑啉酮母核R1 处连接不同基团侧链以考察其对活性的影响，合成具有分子多样性的喹唑啉酮化学库；以特异性α3β1 整合素配体LXY30—生物素—亲和素的复合物形式捕获细胞、偶联抗胱天蛋白酶3 单抗作为探针，运用免疫细胞化学法对肺癌细胞株H1975 进行高通量筛选，以期找到具有抗肺癌活性的小分子多靶点新型2-喹唑啉酮化合物。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：WRS-1B 数字熔点仪(上海申光仪器仪表有限公司)；Magna 750 型傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet 公司)；Waters 2996 高压液相色谱仪(美国Waters公司)；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(美国Billerica公司)；ABI 494蛋白测序仪(美国PerkinElmer 公司)；Avance NEO 600 核磁共振仪(德国Bruker 公司)。试剂：TentaGel S-NH2树脂、Rink AMIDE-MBHA 树脂、Fmoc-保护氨基酸均购自上海吉尔生化公司；LXY30为美国加州大学戴维斯生物化学和分子医药系赠送；其他试剂均属分析纯，购自Sigma公司；人肺癌H1975细胞株购自美国ATCC公司。

1.2 四功能分子骨架N-Alloc-3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸的合成

2-氟苯甲醛(3.00 g，2.4 mmol)、丙二酸(2.75 g，26 mmol)与醋酸铵(4.10 g，53 mmol)混合于25 mL乙醇溶液中，加热回流过夜。反应液冷却至室温，收集析出的白色固体，乙醇(3×50 mL)洗涤3次，乙醚(2×50 mL)洗涤2 次，干燥。将白色固体缓慢加入冰浴的硝酸/硫酸混合物(V硝酸∶V硫酸=1∶1)中，搅拌反应6 h，将黄色反应液倾倒入40 mL的冰水中，用NaOH 调至pH=6，反应液放置室温，减压过滤收集白色固体3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸，水(25 mL)、乙醇(3×50 mL)和乙醚(50 mL)依次洗涤，干燥。将含烯丙氧羰酰琥珀酰亚胺(Alloc-OSu)(0.87 g，4.4 mmol/L)的N, N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide，DMF)溶液逐滴缓慢加入3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸(1.00 g，4.4 mmol)的碳酸氢钠(0.92 g，11 mmol)水溶液中，室温搅拌过夜，乙酸乙酯(2×40 mL)洗涤2次，用HCl 调至pH=3，减压过滤收集白色固体，水(5×50 mL)洗涤并干燥得到四功能分子骨架NAlloc-3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸[10]。见图1。

图1 四功能分子骨架N-Alloc-3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸的合成路线

1.3 OBTC喹唑啉酮类化学库的建立

TentaGel S NH2树脂珠(6.00 g，1.86 mmol)置于水中浸泡24 h 后，过滤除去水；芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(62.74 mg，0.186 mmol)和Alloc-OSu(37.01 mg，0.186 mmol)依次溶解于二氯甲烷/乙醚(300 mL，V二氯甲烷∶V乙醚= 55∶45)混合溶液中，加入N, N-二异丙基乙胺(DIEA)(259.2 μL，1.488 mmol)溶液室温反应45 min；过滤，依次用DMF(5×300 mL)、甲醇(3×300 mL)、DMF(3×300 mL)洗涤；分别于树脂珠中加入含(Boc)2O(2.03g，9.30 mmol)、DIEA(3.24 mL，18.6 mmol)的DMF 溶液45 mL，室温反应1 h；茚三酮检测跟踪反应，确保游离氨基反应完全；得到三功能双层树脂珠2。

三功能双层树脂珠2 中加入20%4-甲基哌啶的DMF 溶液(45 mL)进行芴甲氧羰基Fmoc 保护基的脱除后，加入含D-生物素(227.2 mg，0.93 mmol)，N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三氮唑)六氟磷酸脲(352.7 mg，0.93 mmol)及DIEA(324.0 μL，1.86 mmol)的DMF 溶液中，反应至茚三酮检测为阴性；加入含四(三苯基膦)钯(86.05 mg，0.074 mmol)及苯硅烷(459.0 μL，3.72 mmol)的二氯甲烷溶液(45 mL)进行脱除烯丙氧羰基Alloc保护基的脱除，得到树脂珠3。

分离等量的树脂珠3，分别依次加入10 个不同的Fmoc保护的氨基酸进行缩合反应，直至茚三酮反应呈阴性，得树脂珠4。合并树脂珠4、并加入含四功能分子骨架N-Alloc-3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸(290.6 mg，0.93 mmol)、6-Cl-HOBt(160.5 mg，0.94 mmol)及N,N′-二异丙基碳二酰亚胺(146.8 μL，0.94 mmol)的DMF 溶液，茚三酮反应监测游离氨基反应完全，过滤、洗涤，得树脂珠5。

分离等量的树脂珠5，分别加入8个不同的伯胺进行氟原子的取代反应，DIEA(162 μL，0.93 mmol)，反应1 h，四氯苯醌反应监测二级胺反应是否完全；合并、过滤、洗涤，得到树脂珠6，脱去Alloc 保护基、过滤、洗涤；加入N,N′-羰基二咪唑(120 mg，0.744 mmol)、吡啶(89.25 μL，1.116 mmol)的二氯甲烷溶液，室温反应进行环合，过滤、洗涤，得到树脂珠7；在2 mol/L 二水合氯化亚锡的DMF溶液中进行硝基还原氨基的反应，室温反应48 h；过滤、洗涤，得到树脂珠8。

分离等量的树脂珠8，分别加入10 个不同的羧酸化合物进行缩合反应，茚三酮反应监测游离氨基反应是否完全；合并、过滤、洗涤，得到树脂珠9；采用三氟乙酸Cocktail 裂解液进行目标化合物的侧链保护基及化合物的脱除：82.5%三氟乙酸、5%苯酚、5%苯硫基甲烷、5%水、2.5% TIS裂解2 h；5%DIEA/DMF(2×12 mL)中和，依次使用DMF(3×12 mL)、甲醇(3×12 mL)、二氯甲烷(3×12 mL)、DMF(3×12 mL)，50%DMF/水(3×12 mL)、水(3×12 mL)、70%乙醇(3×12 mL)洗涤，4 ℃储存备用。见图2。

图2 一珠二化合物喹唑啉酮类化学库的合成路线

1.4 免疫细胞化学法筛选喹唑啉酮类化合库

LXY30-生物素与链霉素亲和素的混合物(nLXY30-生物素∶n链霉素亲和素=1∶2)加入含喹唑啉酮类化合库树脂珠的12 孔板中(1.0×105/mL)，37 ℃孵育20 min；磷酸缓冲盐溶液洗涤，加入肺癌细胞H1975，37 ℃孵育20 min；洗涤除去未结合的细胞，孵育24 h；洗涤、4%多聚甲醛固定细胞20 min、5%牛血清白蛋白封闭非特异性蛋白、0.5%Triton X-100使细胞透膜；兔抗人胱天蛋白酶3作为一抗与树脂珠孵育(V兔抗人胱天蛋白酶3∶V树脂珠=1∶100)，4 ℃过夜；磷酸缓冲盐溶液洗涤后，辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG 抗体作为二抗，室温孵育1 h；辣根过氧化物酶活性采用二氨基联苯胺四盐酸盐作为底物检测，树脂珠上黏附红棕色细胞者为阳性树脂珠，并置于显微镜下分离。阳性树脂珠依次用6 mol/L盐酸胍(pH 1.0)、水洗涤，除去树脂珠上残留细胞碎片或蛋白等生物大分子；利用ABI蛋白测序仪进行结构测定[4]。

1.5 碘化丙啶染色法检测阳性树脂珠CA10 的抑癌活性

LXY30-生物素与链霉素亲和素的混合物(nLXY30–生物素∶n链霉素亲和素=1∶2)加入含喹唑啉酮类小分子化合物的树脂珠的12 孔板中(1.0×105/mL)，OBTC 喹唑啉酮类化合库为正常组，阳性树脂珠CA10为实验组；37 ℃孵育20 min；磷酸缓冲盐溶液洗涤，加入肺癌细胞H1975，37 ℃孵育20 min；洗涤除去未结合的细胞，孵育48 h；加入碘化丙啶(1 μg/mL)室温孵育10 min，荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 结构鉴定

3-氨基-3-(2-氟苯基)丙酸：白色固体；产率：58.6%；熔点：211.5～212.1 ℃；红外光谱：1512,1326 cm−1；质谱：m/z 184(M+1)；氢核磁共振 波 谱(600 MHz, D2O)：δ 7.40 (m, 2H), 7.20 (m,1H), 7.15 (m, 1H), 4.93 (t, 1H), 3.10 (m, 2H)。3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸：黄色固体；产率：60.6%；熔点：219.0～219.3 ℃；红外光谱：1519, 1354 cm-1；质谱：m/z 229(M+1)；氢核磁共振 波 谱(600 MHz, D2O)：δ 8.33 (m, 1H), 8.24 (m,1H), 7.33 (t, 1H), 5.00 (t, 1H), 3.11 (m, 2H)。NAlloc-3-氨基-3-(2-氟-5-硝基苯)丙酸：白色固体；产率：63.7%；熔点：141.9～142.3 ℃；红外光谱：1531,1346 cm-1；质谱：m/z 313 (M+1)；氢核磁共振波谱(600 MHz, DMSO-d6) δ 12.46 (s, 1H),8.37 (m, 1H), 8.22 (m, 1H), 8.14 (d, 1H), 7.50 (t,1H),5.88 (m, 1H), 5.27 (m, 2H), 5.16 (d, 1H), 4.45 (m,2H),2.73(m,2H)。

2.2 喹唑啉酮类化学库的高通量活性筛选

合成的OBTC化合库中，1个树脂珠即随机的1 个喹唑啉酮化合物，该化合库包含800 个化合物，其X1为不同氨基酸构成，X2为不同伯胺基团取代，X3为不同羧酸缩合。见图3A。显微镜下可见待检测肺癌细胞贴壁于树脂珠周围，附着红棕色凋亡细胞的为阳性树脂珠(如图3B 箭头所指)，目标化合物可以通过细胞信号级联通路作用于细胞，引发其凋亡且作为OBTC 化合库高通量筛选的阳性树脂珠。

图3 H1975肺癌细胞高通量筛选喹唑啉酮类化合库及阳性化合物结构

2.3 碘化丙啶染色法检测阳性树脂珠CA10 的抑癌活性

OBTC喹唑啉酮类化合库作为正常组，树脂珠上附着细胞未见染色，即肺癌细胞H1975 的活性不受树脂珠上合成化合物的影响；阳性树脂珠CA10则清晰可见碘化丙啶染色呈红色，即附着细胞受CA10作用而死亡。见图4。

3 讨论

一类新药的研发一直以来呈现“三高一长”的显著特点，即“高投入”“高风险”“高回报”和“周期长”。药物发现处于新药开发的源头，是整个新药开发的最关键部分。组合化学主要特点是在较短时间内得到大量具有分子多样性的化合物，并且能够与高通量筛选相结合，大大加快了现代新药发现的过程，在先导化合物的发现及结构优化中发挥重要作用。

图4 碘化丙啶染色法检测阳性树脂珠CA10的抑癌活性

为探讨OBTC 化合库作用于细胞的特异性信号通路，全细胞结合高通量筛选选用免疫细胞化学法优于免疫荧光法，只需在可见光下分离染色的树脂珠即可在普通显微镜下操作，加快了高通量的筛选速度；同时避免树脂珠在低温保存、检查过程中荧光信号的减弱。无论在细胞内源性或外源性的凋亡通路中，胱天蛋白酶3 均被激活，本研究中则采用辣根过氧化酶标记的胱天蛋白酶3抗体作为探针来筛选喹唑啉酮化合库中的促凋亡小分子化合物。LXY30作为捕获肺癌细胞的配体，可高选择性结合癌细胞表面整合素亚型α3β1(IC50=0.08 μmol/L)，因此喹唑啉酮类OBTC 化合库通过配体—生物素—链霉素亲和素复合物的形式使被检测的肺癌细胞靠近树脂珠[11-12]；LXY30直接作用于检测细胞，使其贴壁于树脂珠周围，1个树脂珠即随机的1 个喹唑啉酮化合物，喹唑啉酮类化合物可以通过细胞信号级联通路作用于细胞，引发其凋亡从而作为OBTC 阳性树脂珠被筛选出来。本研究经高通量筛选得到阳性化合物CA10，CA10表现较好的抑制肺癌细胞活性。

含有氮杂环的喹唑啉衍生物结构具有广泛的生物活性，如抗菌、抗炎、抗肿瘤及抗病毒等[13-14]，特别是4-喹唑啉酮结构，而其同分异构体2-喹唑啉酮的研究较少。本研究中2-喹唑啉酮类化合库的多样性是通过四功能骨架分子分别引入不同取代基来完成，各个反应物因立体效应、电性效应等反应活性不一，则目的化合物收率不同，初筛结果可能存在假阳性。因此，本研究依据OBTC 法重新合成阳性化合物，免疫组化法再验证目标化合物对肺癌细胞的促凋亡作用或不可缺；但全细胞高通量筛选因为方法选择及测定指标有限，目标化合物的抗肿瘤活性优劣程度及分子生物学作用机制仍需要体内外细胞及整体模型的再验证，特别是重要的肝毒性评价指标，将在后续工作中进一步探讨。

OBTC组合化学库结合高通量筛选的方法在新药研制过程中逐渐显示出其高效、经济、可行的优势特点[15-16]，尽管OBTC 化合库仍需考虑树脂珠内层解序标签的合成，但一次合成、一次分析的模式避免了后期漫长琐碎的若干化合物合成、分析的传统模式，为诸多新药研发的科研工作者优先考虑。

综上所述，本研究通过OBTC 组合化学库结合高通量筛选的方法获得抑制肺癌细胞活性较好的化合物CA10，可作为先导化合进行进一步结构优化。