高效液相色谱法同时测定刺三加叶中芦丁和没食子酸含量

2021-04-18高林晓石慧丽文冬冬杨再波邹洪涛

理化检验-化学分册 2021年4期

高林晓 ,石慧丽 ,文冬冬 ,郭蒙 ,杨再波 ,邹洪涛

(1.黔南民族师范学院化学化工学院,都匀 558000;2.贵州省普通高校民族药用植物资源开发工程研究中心,都匀 558000;3.中国食品发酵工业研究院有限公司,北京 100015)

刺三加为五加科五加属植物,主要分布于我国的华南、西南等地区,其根、茎、叶、带叶嫩枝等均可入药,在亚洲东南亚地区甚至把刺三加作为与人参等同价值的药物使用。已有一些针对刺三加的化学成分、提取工艺、药理毒理活性等的综述报道[1-6]。

近来,关于刺三加的研究仍然受到国内学者的持续关注。文献[7]用铁氰化钾紫外-可见分光光度法测定了刺三加叶中多酚的含量,并进一步研究了其根、茎、叶等部分的总多酚的提取[8-9];文献[10]研究了5个刺三加品种嫩枝叶中的总多酚含量,结果发现青梗品种中总多酚含量最高,并与体外抗氧化显著相关;文献[11]比较了5种型号的大孔树脂对刺三加叶提取液中总多酚的吸附和解吸性能,发现纯化多酚的最佳树脂为HPD-100树脂,纯化后总多酚的质量分数测定值可增大3.25倍;文献[12]对刺三加醇提物进行不同溶剂萃取,结果表明,乙酸乙酯萃取效果最好,但石油醚层的物质抑菌活性最佳,且与黄酮含量间存在非简单正比的相关性。此外,文献[13]进一步研究了刺三加醇提物的乙酸乙酯层物质在体外或体内抑制脂多糖诱导的炎症反应,预测提取物是预防和治疗急性肺损伤的潜在新型药物;文献[14]利用刺三加叶片和陈皮等通过成型工艺制备成胶囊,结果表明,其生产过程中,需要控制相对湿度小于81%;文献[15]用水提醇沉法提取了刺三加全草的多糖,并对其添加交联聚维酮等制备成分散片,多糖溶出率高达85%;而文献[16-18]进一步纯化了刺三加茎的多糖,得到以葡萄糖为主的一种中性均一的白簕多糖ATP-1,结果发现,其不仅展现出良好量效关系的抗氧化性,而且还可以有效降低糖尿病小鼠的血糖、修复受损的糖代谢;文献[19-20]用高效液相色谱法(HPLC)测定了刺三加叶中绿原酸、根与茎中没食子酸的含量;文献[21]用高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)对刺三加中贝壳杉烯酸的含量进行了测定。

刺三加具有调节胃肠道功能,预防便秘、肠癌等疗效[22]。这是因为它富含黄酮类、酚酸类等抗氧化剂,其中,芦丁在促进血液循环、降血脂、防治高血压、抗氧化等方面有显著疗效[2],以抗氧化活性为基础,所开发研制的白簕茶也已进入我们生活,由于其对强身健体和抗老化有显著作用而得到广泛推广[23]。已报道的芦丁含量测定方法有HPLC[24-25]、毛细管电泳法(CE)[6]、电化学发光检测法(ECL)[26]和流动注射液滴荧光检测法(FILDS)[27]等。虽已有HPLC同时测定植物中芦丁、没食子酸等含量的报道[28-29],但尚未见HPLC同时测定刺三加叶中二者含量的报道。因此,本工作对来自不同产地的刺三加叶中芦丁和没食子酸进行了提取,然后用HPLC同时测定二者含量,以期为建立刺三加的标准方法和进一步深入地研究刺三加的药用价值提供数据支撑。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪;TU-1901 型紫外可见分光光度计;DL-360D 型智能超声波清洗器。

对照品储备溶液:称取芦丁和没食子酸0.011 0 g和0.021 6 g,加入适量60%(体积分数,下同)乙醇溶液溶解,以水定容至100 mL 容量瓶中,保存备用。

对照品溶液:移取上述5.00 mL 芦丁对照品储备溶液和1.40 mL 没食子酸对照品储备溶液,分别置于100 mL容量瓶中,以水定容,得到5.50 mg·L-1芦丁和3.02 mg·L-1没食子酸对照品溶液。

芦丁、没食子酸、甲醇和乙腈均为色谱纯;其他试剂均为分析纯;试验用水为二次蒸馏水。

刺三加叶采自广东恩平和贵州都匀。

1.2 色谱条件

ZORBAXSB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为CH3OH-H2O-CH3COOH(体积比为44∶55.6∶0.4)溶液;芦丁和没食子酸检测波长分别为260,272 nm;流量1.0 mL·min-1;进样量10μL;柱温25 ℃。

1.3 试验方法

称取过孔径0.425 mm(40目)筛的刺三加叶样品25.00 g置于锥形瓶中,加入250 mL 沸水浸泡,静置5 min,冷却后过滤,上述操作重复1次,收集滤渣。滤渣中加石油醚100 mL 继续浸泡,静置3 h,重复4～5次,此时石油醚层接近无色,抽滤,收集滤渣作为试验用样品[30]。

称取2.00 g上述滤渣样品,置于锥形瓶中,加入60%乙醇溶液100 mL,密塞,称重,于100 W 功率下超声提取30 min,冷却到室温。重复操作1次,再加入60%乙醇溶液补足质量减少量,用0.45μm滤膜过滤提取液,滤液为供试液,按色谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

取一定量的芦丁和没食子酸的对照品溶液,分别在波长200～400 nm 处进行紫外吸收光谱扫描。结果发现:芦丁在260,354 nm 处,没食子酸在215,272 nm 处均有吸收峰;而260 nm 处的芦丁吸收峰、272 nm 处的没食子酸吸收峰基线平稳,峰形对称性好,杂质峰的干扰少。故试验选择260 nm、272 nm分别作为芦丁和没食子酸的检测波长。

2.2 提取方法的选择

试验测定前需对刺三加叶进行脱脂和脱色处理。查阅资料,煮沸浸提可破坏部分细胞膜,除去一些叶绿素,但由于叶绿素是脂溶性色素,采用有机溶剂浸渍技术更有利于其提取,故试验先采用水粗提法,然后再用石油醚对其进行脱脂、脱色。

试验对水、甲醇和乙醇等溶剂作提取溶剂的提取效率进行了对比,结果发现:以水作为提取溶剂时,样品有效成分的提取率较低,且杂峰较多;以甲醇或乙醇作为提取溶剂时,两者提取的有效成分的含量无差别、杂质峰均较少,但考虑到前者具有较强的毒性,最终选择乙醇作为提取溶剂。试验结果表明:在60%乙醇溶液作提取溶剂、用量为100 mL、超声提取30 min 的条件下,目标组分提取效果最佳。

2.3 色谱条件的选择

分别首先考察了芦丁和没食子酸在CH3OHH2O、CH3OH-H2O-CH3COOH (或 H3PO4)、CH3CN-H2O、CH3CN-H2O-CH3COOH (或H3PO4)等流动相体系中的色谱保留行为[31-33],结果表明:以体积比为44∶55.6∶0.4 的CH3OHH2O-CH3COOH 溶液为流动相时,目标组分分离效果最佳,色谱峰峰形对称性好、背景噪声干扰小、重现性好。此外,还考察了柱温(20,25,30,35 ℃)和流量(0.6,0.8,1.0 mL·min-1)等因素对两种目标组分的分离效果的影响,结果表明:在柱温为25 ℃、流量为1.0 mL·min-1时,目标组分的色谱峰峰形具有良好的对称性,理论塔板数相对也较高。

2.4 专属性试验

分别取经0.45μm 滤膜过滤的60%乙醇溶液空白、对照品溶液和供试液,在色谱条件下进样测定,所得HPLC谱图见图1。

图1 HPLC谱图Fig.1 HPLC chromatograms

由图1 可见:芦丁和没食子酸的分离度大于1.5,根据所得二者的色谱峰计算理论塔板数大于2 000,说明该方法分离效果良好,且其他成分无干扰。

2.5 标准曲线、检出限和测定下限

移取10.0 mL芦丁和2.4 mL 没食子酸的对照品储备溶液,分别置于100 mL 容量瓶中,以水定容,作为线性储备溶液。分别移取0.50,1.00,2.00,4.00,6.00,8.00,10.0 mL 的芦丁、没食子酸线性储备溶液置于10 mL 容量瓶中,以水稀释配制芦丁、没食子酸标准溶液系列,按色谱条件进行测定。以芦丁和没食子酸的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,结果表明:芦丁和没食子酸的线性范围分别为0.55～11.00 mg·L-1和0.26～5.18 mg·L-1;线性回归方程分别为y芦丁＝17.54x芦丁＋0.264 0 和y没食子酸＝27.51x没食子酸-2.683;相关系数分别为0.999 9,0.999 0。

根据3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限,芦丁和没食子酸的检出限(3S/N)分别为0.04,0.03 mg·L-1;根据10 倍信噪比计算方法的测定下限,芦丁和没食子酸的测定下限(10S/N)分别为0.11,0.08 mg·L-1。