基于纳米颗粒构建的酶联增敏生物传感器测定水中Cd2＋

2021-04-18温丽苹程云辉

理化检验-化学分册 2021年4期

温丽苹 ,李琳 ,程云辉 ,丁利 ,许宙∗

(1.长沙理工大学化学与食品工程学院,长沙 410114;2.湘潭大学化工学院,湘潭 411105)

重金属污染是一个全球性问题,镉是一种常见的重金属元素,主要应用于油漆着色、镍镉电池和电镀等工业领域,因此广泛分布于空气、水、土壤等环境中[1]。镉是一种累积毒素,经食物链和水摄入,在肺、肾和肝脏等人体器官中积累后,会对人体的肾脏、肝脏、心血管、神经等方面造成损害[2-5]。以尿镉计,镉的生物半衰期男性为11～19 a,女性为18～35 a[6]。镉污染已经严重威胁到人类健康,已被列为环境与食品污染的主要公害之一[7]。世界卫生组织和美国环境保护署规定饮用水中Cd2＋的限量标准为3μg·L-1[7-8]。因此,对水样中低含量Cd2＋的测定要求越来越高。迄今为止,已开发出许多方法用于测定环境和生物样品中Cd2＋的分析,如原子吸收光谱法[9]、电感耦合等离子体质谱法(ICPMS)[10]、表面增强拉曼光谱法[11]、电感耦合等离子体原子发射光谱法[12-13]等。但这些分析方法常需要专业人员操作,且存在耗时长、成本高、操作复杂等问题,因此迫切需要建立一种低成本的快速测定Cd2＋的方法,这对环境监测和保障人身健康至关重要。

近几十年来,随着纳米科技的发展,纳米材料由于具有灵敏度高、特异性好、快速经济的突出优势,用于物质快速分析的研究受到了人们的广泛关注[14-15]。如基于超顺磁性和亲和分离原理的磁性纳米材料已成功地应用于脱氧核糖核酸(DNA)、多糖、蛋白质、重金属及毒素等的测定[16-19]。近年来,由于抗原-抗体的免疫识别作用可以有效地提高测定方法的特异性,关于综合利用磁性纳米材料与其他纳米材料,并结合抗原-抗体的特异性免疫识别作用构建竞争性免疫传感器用于测定毒素、细菌的研究相继被报道[20-21]。

基于此,本工作拟利用磁纳米颗粒和金纳米颗粒(Au NPs)为载体,表面分别进行镉-抗原和镉-抗体的功能化,并于功能化Au NPs表面修饰乙酰胆碱酯酶(ACh E),从而构建了ACh E 酶联增敏生物传感器。方法基于抗原-抗体的免疫识别作用驱动磁纳米颗粒和Au NPs发生竞争性自组装形成组装体,组装体催化底物乙酰胆碱(ACh)水解产生乙酸,引起反应体系的酸度变化,实现对Cd2＋的高特异性与高灵敏度的测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

PHBJ-260型pH 计;JEOL JEM-2100 型透射电子显微镜(TEM);Zetasizer nano型激光粒度仪;85-2型数显恒温磁力搅拌器;HH-WO-2型恒温油水浴锅;TG16-WS型台式高速离心机。

Cd2＋标准溶液:1.0μg·L-1。

pH 7.4的0.05 mmol·L-14-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液:将2.38 g(10 mmol)HEPES溶于180 mL水中振摇至全溶,一边搅拌一边缓慢滴加0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液至pH 为7.4,然后用水定容至200 mL。

所用试剂均为分析纯,试验用水为超纯水。

1.2 试验原理

Fe3O4磁纳米颗粒用镉-抗原进行功能化修饰,Au NPs用镉-抗体和AChE进行功能化修饰。当体系中不存在Cd2＋时,大量ACh E 修饰的功能化Au NPs与功能化Fe3O4结合,磁分离后,Fe3O4-抗原-抗体-Au NPs-AChE 组装体催化底物ACh 水解产生大量乙酸,引起体系反应前后较大的pH 变化(反应前后的pH 差值以ΔpH 表示);而随着Cd2＋的增加,Cd2＋会和功能化Fe3O4产生竞争,被功能化Au NPs 上的镉-抗体特异性识别,磁分离后,Fe3O4-抗原-抗体-Au NPs-AChE 组装体减少,其催化底物ACh水解引起体系的ΔpH 较小。基于此原理,可根据反应体系ΔpH 与Cd2＋的含量绘制标准曲线,实现对Cd2＋的测定。

1.3 试验方法

1.3.1 Fe3O4磁纳米颗粒的制备及其功能化修饰

采用水热法[22]合成Fe3O4磁纳米颗粒:于烧杯中加入15 mL 乙二醇,分别添加1.2 g 乙酸钠和0.5 g六水合氯化铁搅拌至溶解,称取0.375 g聚乙二醇继续加入上述混合液中,搅拌4 h使其充分溶解。将该溶液全部转移到聚四氟乙烯内胆中,并置于不锈钢反应釜中,于210 ℃油浴锅中加热反应12 h。待反应釜冷却后,将得到的黑色产物用无水乙醇和水各洗涤3次,并于无水乙醇中保存备用。

抗原功能化Fe3O4(Fe3O4-抗原)的制备:将文献[23-24]报道的方法做适当调整,取200μL 上述制备的Fe3O4溶液于离心管中,加入25 μL 的0.6 g·L-11-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液和25μL的0.4 g·L-1硫代羟基琥珀酰亚胺溶液混匀作为A 液;将20μL的0.1 g·L-1镉-抗原溶液加入到980μL 的0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中作为B 液。将以上A、B 两种溶液混合,室温下摇床孵育反应1.5 h 得到Fe3O4-抗原,以6 000 r·min-1转速离心10 min,用适量0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)洗涤一次后将沉淀物复溶于1 mL 的10 g·L-1牛血清白蛋白溶液中,于4 ℃保存备用。

1.3.2 Au NPs的制备及其功能化修饰

采用柠檬酸钠还原法[25]制备Au NPs:取97.5 mL水及2.5 mL的1 mmol·L-1氯金酸溶液加入到锥形瓶中,高速磁力搅拌加热至沸腾,保持7～8 min后迅速加入2 mL的10 g·L-1柠檬酸三钠溶液,加热15 min后,持续搅拌约15 min,冷却至室温,于4 ℃保存备用。

抗体功能化Au NPs(Au NPs-抗体)的制备:用pH 8.0的0.002 mol·L-1硼酸盐缓冲溶液将抗体稀释至6 mg·L-1,取1 mL 作为C 液备用;另取1 mL制得的Au NPs溶液并向其中加入8μL 的0.1 mol·L-1碳酸钾溶液混匀,作为D 液。将上述C、D 两种溶液混合,室温下摇床孵育50 min后加入50μL 100 g·L-1的牛血清白蛋白溶液,在室温下摇床孵育2 h。将孵育后的混合物以7 000 r·min-1转速离心25 min,并将沉淀物重悬于含有50 g·L-1海藻糖的0.002 mol·L-1硼酸盐缓冲溶液(pH 8.0)中,于4 ℃保存备用。

ACh E修饰Au NPs-抗体(ACh E-Au NPs-抗体)的制备:将50μL Au NPs-抗体溶液与10μL 的1 g·L-1ACh E溶液混合均匀,黑暗环境中于室温摇床孵育2 h,以6 500 r·min-1转速离心15 min,弃去上清液,沉淀物重悬于50μL水中备用。

1.3.3 螯合剂的制备

游离的Cd2＋不能被镉-抗体直接识别,需先将Cd2＋与乙二胺四乙酸反应生成螯合物,才能与抗体结合。

将0.05 mol·L-1HEPES缓冲溶液(pH 7.4)和50 mmol·L-1的乙二胺四乙酸溶液以体积比10∶1混合均匀作为螯合剂。取50μL 的待测水样加入到离心管中,并向离心管中加入50μL 上述螯合剂,于室温下摇床孵育2 h。

1.3.4 ΔpH 的测定

分别移取50 μL Cd2＋标准溶液和30 μL Fe3O4-抗原溶液混合均匀,加入100μL 的ACh EAu NPs-抗体溶液,室温下摇床孵育反应1 h,磁分离后除去上清液,重悬于200μL 的25 mmol·L-1ACh溶液中,水解1 h,用pH 计测定水解前后体系的Δp H。

2 结果与讨论

2.1 材料的表征

纳米材料的尺寸、粒径、分散性会直接影响纳米材料在功能化修饰和特异性结合时的效果[26]。Au NPs、Fe3O4、Au NPs-Fe3O4复合物的TEM 图见图1。

由图1可知:制备的Au NPs、Fe3O4分散性较好,颗粒大小相对均匀,其平均粒径分别为13,125 nm;当体系中没有Cd2＋存在时,功能化Au NPs和功能化Fe3O4通过抗原-抗体间的特异性识别顺利组装,得到Au NPs-Fe3O4复合物,其平均粒径为140 nm。

图1 Au NPs、Fe3O4、Au NPs-Fe3O4复合物的TEM 图Fig.1 TEM images of Au NPs,Fe3O4and Au NPs-Fe3O4complex

动态光散射测得的材料的平均粒径(水合粒径)一般比材料的实际粒径略大,这是因为动态光散射测得的是材料的流体动力学直径[27],但该表征方法仍可用来分析纳米颗粒的尺寸变化。

Au NPs、Fe3O4、Au NPs-抗体、Fe3O4-抗原和Au NPs-Fe3O4复合物的水合粒径见图2。

图2 Au NPs、Fe3O4、Au NPs-抗体、Fe3O4-抗原和Au NPs-Fe3O4复合物的水合粒径Fig.2 Hydrated particle sizes of Au NPs,Fe3O4,Au NPs-antibody,Fe3O4-antigen and Au NPs-Fe3O4complex

由图2可知:所合成的Au NPs和Fe3O4的水合粒径均呈正态分布,平均水合粒径分别为22,510 nm;Au NPs-抗体和Fe3O4-抗原的平均水合粒径分别增加至46,613 nm;当没有Cd2＋存在时,Au NPs-抗体和Fe3O4-抗原通过抗原-抗体间的特异性识别作用形成Au NPs-Fe3O4复合物,平均水合粒径增加到740 nm。

2.2 标准曲线和检出限

用水将1.0μg·L-1Cd2＋标准溶液依次稀释成0.001,0.020,0.050,0.100,0.200,0.500,1.00,2.00,5.00,10.0μg·L-1的Cd2＋标准溶液系列。按试验方法测定Cd2＋标准溶液系列的Δp H,将ΔpH 与Cd2＋的质量浓度(ρ)进行拟合,绘制标准曲线。结果表明:反应体系的ΔpH 与Cd2＋质量浓度的对数值lnρ成负相关,Cd2＋的线性范围为0.001～10.0μg·L-1,线性回归方程为y＝-0.177 8 lnρ＋0.504 0,相关系数为-0.997 0。

以平行测定10次的空白样品的3倍标准偏差(s)除以标准曲线斜率(k)计算方法的检出限(3s/k),结果为0.24 ng·L-1。

几种基于纳米材料测定Cd2＋的方法参数对比见表1。

由表1可知:将酶联增敏法(本方法)与基于纳米材料测定Cd2＋的其他方法进行比较,本方法的检出限较低,具有一定的优势。

2.3 特异性试验

为评价制得的酶联增敏生物传感器(Cd2＋传感器)的特异性,选用Cu2＋、Hg2＋、Zn2＋、Pb2＋、Co2＋作为可能存在的共存重金属离子进行特异性试验。分别配制10μg·L-1的Cu2＋、Hg2＋、Zn2＋、Pb2＋、Co2＋标准溶液,按试验方法测定其Δp H。结果表明:Cd2＋、Cu2＋、Hg2＋、Zn2＋、Pb2＋、Co2＋的ΔpH 依次为0.92,0.03,0.02,0.01,0.03,0.01。可以看出:该酶联增敏生物传感器对10μg·L-1的其他重金属元素响应较弱,故Cd2＋测定方法特异性良好。

表1 几种基于纳米材料测定Cd2＋的方法参数对比Tab.1 Comparison of parameters obtained by several determination methods for Cd2＋based on nanomaterials

2.4 回收试验

移取适量空白的自来水样品、湖水样品和池塘水样品,用0.22μm 滤膜将水样过滤,在14 000 r·min-1转速下离心15 min,去除水样中可能存在的悬浮颗粒物。按试验方法对上述过滤、离心后的空白水样进行加标回收试验,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),同时,采用ICP-MS[33]进行测定,样品分析结果见表2。