中医药对骨关节炎信号通路研究进展

王俊峰，关雪峰，杨永菊

( 1,辽宁中医药大学,辽宁 沈阳 110847; 2.辽宁中医药大学附属医院,辽宁 沈阳 110032)

骨关节炎(OA)是一种常见的骨关节慢性退行性病变，发病率约占我国人口的18%[1]。目前对于OA的治疗，尚无有效的治疗方案，而中医药对于OA的治疗有着广阔的前景，OA的发生发展与炎症因子、氧化应激、细胞凋亡自噬等有着密切联系，且其中多为信号通路介导。本文就细胞信号通路的抑制和促进两个方面，分别探讨中医单体、复方、针灸、手法等疗法对OA信号通路的影响,以期对日后的研究提供相应的参考。

1 骨关节炎的发生与治疗机制

现代医学认为OA的特征性改变是软骨的降解，当人体关节发生退变后，会引起关节软骨细胞的基质组成和代谢水平发生相应变化，这些变化可以引起细胞因子的释放，释放的细胞因子会激活相关细胞通路从而加重骨关节的破坏，发生骨关节炎。目前较为推崇OA的治疗机制为中医药通过改善OA局部微循环，降低局部炎症因子浓度，改善关节软骨和滑膜细胞的新陈代谢，抗氧化及细胞凋亡等，从而减弱和延缓细胞通路相关蛋白的表达，促进关节软骨修复，达到治疗骨关节炎的效果[2]。

2 中医药对于OA抑制信号通路的研究

2.1 Wnt/β-catenin信号通路

Velasco等[3]发现Wnt信号通路对关节内软骨的形成及分化具有双向调节作用, 既可以促进软骨的发生和发展, 又可以促进软骨的退变与凋亡。Wnt信号传导途径与4个细胞内途径有关，其中经典信号途径最为重要，也是目前研究较多的信号通路，其可概括为以下途径:Wnt与受体蛋白结合→Frz→Dsh→β-catenin的降解复合体解散→β-catenin积累→细胞核→TCF/LEF→基因转录如c-myc、cyclinD1y。除上述信号通路传导外，Wnt/β-catenin信号通路还包含重要的负向调节因子抑制其进程，最常见的为抑制因子DKK1，硬化蛋白和分泌型Fz相关蛋白。目前中医药对于Wnt/β-catenin信号通路的研究，补肾活血类中药及复方研究较多，且靶点多集中在Wnt和β-catenin蛋白检测。

中药丹参具有活血调经，祛瘀止痛之功效，其主要成分为丹参酮ⅡA，宋奕等[4]研究发现丹参酮ⅡA可以通过下调β-catenin信号通路中β-catenin蛋白的表达，从而达到治疗骨关节炎的效果，猜测这与丹参酮ⅡA可以抑制β-catenin信号通路表达，延缓软骨细胞的退变，促进软骨基质Ⅱ型胶原蛋白的合成有关。黄芪甲苷为中药黄芪的主要组成成分，MMP-7是软骨基质降解的重要因素，而COMP、CTX-Ⅱ是软骨基质分解的产物，实验证实黄芪甲苷可明显降低滑膜软骨中MMP-7、COMP、CTX-Ⅱ蛋白的表达[5]，这与黄芪甲苷抑制Wnt/β-catenin信号通路改善改善滑膜-软骨微环境，促使软骨细胞功能恢复有关。研究学者利用Westernblot方法检测蛋白表达，证实了姜黄素可通过抑制Wnt2、GSK-3β、β-catenin的表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路，达到促进软骨细胞增殖的目的[6]。

WIF1是一种能够抑制Wnt信号通路的胞外蛋白质。研究发现经典方剂右归丸可以通过提高WIF1蛋白的合成及降低其下游基质金属蛋白酶和IL-6的表达，达到抑制Wnt信号通路，促进细胞凋亡的作用[7]。邝高艳等[8]通过研究发现加味独活寄生汤可以抑制1L-β炎症因子的表达，进而降低Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin mRNA的表达，猜测其可能与内质网应激性凋亡、细胞自噬等有关。在探究中医药对于Wnt/β-catenin信号通路作用中，赵婧等[9]研究发现祛痰化瘀利湿方可以抑制GSK-3β蛋白，下调β-catenin、CyclinD1、MMP-7蛋白的表达，提示祛痰化瘀利湿方可以抑制β-catenin核移位，降低靶基靶基因蛋白的表达，改善软骨损伤。

2.2 NF-κB信号通路

NF-κB信号通路参与介导软骨细胞的增殖、分化、炎症，凋亡等多种过程，在OA的发生、发展、变化过程中起着重要的作用[10]。有研究证实当细胞受到促炎因子或病原体相关分子刺激后，会促使IKK的合成，同时使ⅠκB蛋白磷酸化，之后ⅠκB再发生泛素化，引起ⅠκB水解，释放NF-κB，进一步调节NF-κB相关基因表达。目前对于NF-κB信号通路的研究多集中在炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α及核转录因子NF-κB，公认的机制为相关诱因诱导NF-κB通路激活，引起炎性因子释放加重软骨退变，从而诱发OA。

中药龙胆具有“活血舒筋、祛风除湿”的功效，常与其他药物配伍治疗关节疼痛。黄力鹏等[11]将30只雄性SD大鼠随机分为模型组、治疗组和对照组，研究发现较比于其他两组，治疗组大鼠关节软骨中NO、TNF-α及NF-κB蛋白含量明显减低，而I-κB蛋白表达明显增高。提示龙胆苦苷可以抑制炎症因子，促进I-κB合成，进而诱导I-κB与NF-κB结合形成非活性的二聚体，抑制了NF-κB在细胞之间的穿梭，起到抑制NF-κB信号通路，改善骨关节炎症状的作用。中药枸杞具有补肝肾，强筋骨的功效，其主要成分为枸杞多糖，实验研究发现[12]，枸杞多糖能够有效降低关节软骨细胞中IL-1β、TNF-α、iNOS炎性细胞因子及NF-κBp65蛋白水平，提示枸杞多糖可以下调趋化因子和促炎介质水平，抗氧化损伤，抑制NF-κB信号通路，改善骨关节炎症损伤。研究发现白芍中的有效成分白芍总苷可以促进人骨关节炎软骨细胞增殖，同时促进NF-κB通路中Bcl-2表达，降低Bax、Caspase-3、MMP-13 /TIMP-1的表达水平，抑制IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞TNF-α、IL-6和IL-8的分泌[13]。朱海泉等[14]研究发现川芎中分离出的川芎嗪可以抑制Ⅱ型胶原合成、增强MMP-13的表达，降低NO、TNF-α和IL-6水平，提示这与减弱NF-κBP65磷酸化水平有关。

《金匮要略》中治疗寒湿痹症型OA的乌头汤对NF-κB信号通路中的NF-κBp65蛋白表达有明显的抑制作用，提示这可能与乌头汤抑制一氧化氮合酶、IL-1β、IL-6、IL-18、和TNF-α炎症因子的的释放，改善软骨细胞炎性状态有关[15]。许丽梅等[16]通过研究发现独活寄生汤可通过抑制IL-1β、TNF-α及MMPs的生成，抑制NF-κB蛋白核转位, 减轻脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应，延缓软骨退变。ACT1是NF-κB信号通路活化蛋白，万磊等[17]发现补肾活血类中药汤剂消瘀接骨散对NF-κB衔接蛋白激活剂1及ACT1具有明确的抑制作用，猜测消瘀接骨散可能通过抑制IL-1、IL-17表达，抑制ACT1激活NF-κB过程，改善骨关节炎血瘀状态。周叶等[18]研究证实独活寄生汤和身痛逐瘀汤化裁而来的骨痹活血汤可通过SphK1-S1P信号轴抑制NF-κB信号通路的激活，降低SphK1、S1P、NF-κB，MMP-3因子水平的表达。

2.3 TGF-β信号通路

TGF-β受体有3种形式分别为TβRⅠ型、TβRⅡ型和TβRⅢ型，当TGF-β信号分子先与Ⅱ型受体结合活化，之后再磷酸化Ⅰ型受体，最后通过smad蛋白向细胞核内传递信息，改变细胞行为。TGF-β信号通路中与骨关节软骨有关的信号通路包含两个，分别为ALK5经smad2、3传导引起的TGF-β信号通路和ALK1经smad1、5、8介导的BMP信号通路，TGF-β通路可以抑制软骨细胞的分化，而BMP通路的可以促进软骨细胞的分化[19]。这两种信号通路的介导都与Ⅹ型胶原(COL-X)、基质金属蛋白酶-13等多种因子参与有关。目前对于TGF-β信号通路的研究大多是中药复方研究，且效应因子多集中在TGF-β1和IL-1。

中药鹿茸具有壮肾阳，益精血，强筋骨的功效，Smad6、7为TGF-β信号通路的抑制因子，Smad蛋白1、2、3、5、8、9为膜受体激活剂，卢贺等[20]将健康雌性SD大鼠50只随机分为5组，结果显示鹿茸灌胃组血清Smad2、3的表达量明显升高，而Smad6、7的表达量明显降低。这提示鹿茸可以通过激活Smad2、3，抑制Smad6、7信号传导，达到促进关节软骨的修复的作用。也有研究表明[21]，丹参酮ⅡA能够促进BMP-2生成，达到诱导间充质前体细胞向成骨细胞分化的作用。

杨帆等[22]研究发现补肾活血方可以通过调节TGF-β1、BMP-4和BMP-7的分泌，以此来保护受损的软骨细胞，缓解病情的进展。研究证实益气活血的中药汤剂消骨痛汤能通过调节骨关节炎软骨细胞中TGF-β1和BMP2的表达水平，以此来刺激软骨蛋白多糖的合成，达到促进软骨细胞的修复和再生，维持关节软骨的内环境平衡的作用[23]。

在研究火针对于膝关节退行性病变的机制中发现[24]，火针治疗可有效改善大鼠膝关节软骨损伤状态，降低血清及膝关节软骨组织中 MMP-3、TGF-β1和TNF-α因子的表达。同样，电针刺激患者“梁丘”、“内膝眼”、“血海”、“犊鼻”、“阿是穴”等穴位和普通针刺大鼠后肢膝关节“膝前”、“后三里”和“阳陵泉”也可以明显抑制KOA血清中TGF-β1的表达[25,26]，这都与其可以改善能够改善局部组织水肿、渗出及加快局部组织微循环，改善炎性状态，促进软骨细胞修复有关。

2.4 PERK / Bip信号通路

冷刺激、机械损伤等应激刺激均会激活内质网应激信号通路，引起细胞凋亡。内质网应激与3种蛋白的调控有关，分别为PERK、IRE1、ATF6。研究发现，活化后的PERK、IRE1及ATF6蛋白会通过增强Caspase-12的转录活性引起细胞凋亡[27]。其中PERK /Bip是启动内质网应激性凋亡重要信号传导途径。在探求中医药对大鼠的软骨退变的实验中，对于PERK / Bip信号通路研究较多为中药方剂独活寄生汤。

叶锦霞等[28]将培养第三代的软骨细胞分为空白组、模型组、实验高、中、低剂量组。以AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率，实验发现实验组ATF4、BIP、Caspase-3、Caspase-12的含量均低于其他两组。提示透骨消痛胶囊可以抑制TG的轴向作用，使Caspase-12和Caspase-3活性减低，抑制PERK信号通路引起的细胞凋亡过程。赵林灿等[29]采用寒冷刺激法建立膝骨性关节炎模型，研究发现独活寄生汤可明显下调TNF-α、IL-1β等炎症因子表达，并使软骨细胞中的PEAK、Bip、Caspase-9的mRNA的表达也明显下降，这与独活寄生汤通过抑制炎症因子下调PEAK/Bip信号通路，改善软骨细胞凋亡状态有关。陈俊等[30]研究发现独活寄生汤还可抑制PEAK因子的下游eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3的蛋白表达，猜测这与独活寄生汤可抑制PERK / Bip信号通路的表达有关。

2.5 Toll样受体信号通路

Toll样受体是一种模式识别受体，与炎症的发生有着密切的联系，现代研究认为Toll样受体引起的固有免疫应答是促使OA发生的重要环节。目前已知的Toll样受体家族有成员有13个，而TLR1至TLR10均在人类均有表达，当Toll样受体与衔接蛋白衔接后会激活MyD88依赖性与MyD88非依赖性两条通路[31]，其中TLR2、TLR4是与OA最为密切的信号传导途径。目前探究骨关节炎Toll样受体信号通路机制中，中医药对于MyD88依赖性信号通路研究较多。

青藤碱是青风藤的主要成分，研究表明青藤碱中、高剂量组TLR2、TLR4、MyD88的mRNA和蛋白表达较空白组和低剂量组均具有明显下调，猜测其可能通过抑制固有免疫，达到下调TLR/MyD88信号通路表达的作用[32]。《伤寒论》中经典药对桂枝芍药具有温经通脉、柔筋之痛之功效，研究发现桂枝和芍药可不同程度的抑制关节软骨表面TLR2、TLR4的阳性表达和细胞上清中IL-1β、MMP-13的分泌，其可能是通过抑制炎症因子，下调Toll样受体信号途径，抑制机体固有免疫[33]。

在对于膝骨关节炎组织形态学和固有免疫的研究中，发现通络止痛方也可明显抑制TLR4、NF-κB、MyD88蛋白的表达，进而抑制滑膜细胞增生及炎症反应，减缓软骨退变[34]。有研究学者提出NF-κB可能是TLR4引起下游细胞因子分泌的枢纽，陈俊等[35]发现乌头汤不仅可以作用NF-κB p65信号靶点，也可以降低TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达，达到抑制膝骨关节炎滑膜炎症的作用，其机制可能是乌头汤通过下调TLR4信号通路，抑制NF-κB的表达，进而改善滑膜功能。研究发现[36]，火针针刺内外膝眼、足三里联合玻璃酸钠，可降低治疗组外周血TLR4浓度，达到保护关节软骨的效果。推拿手法对TLR4信号通路也有抑制作用，在给予大鼠膝关节的内膝眼、外膝眼、血海、梁丘等穴行一指禅推法后，推拿可以降低膝骨关节炎大鼠滑膜组织TLR4、MyD88 mRNA的表达水平，从而抑制炎症反应[37]。经筋微创松解术也可抑制TLR4、MyD88的表达，改善膝骨关节炎患者关节疼痛、活动障碍等症状[38]。

2.6 MAPK信号通路

MAPK信号通路的激活与细胞凋亡、炎症反应等多种生物学效应密切相关，是调节骨关节炎软骨损伤最为重要的信号通路。MAPK信号通路遵循三级激酶级联反应进行，即为磷酸化的MAP3K可激活MAPKK，磷酸化的MAPKK再激活MAPK，并使其磷酸化。MAPK信号通路主要包括ERK1/2通路、JNK通路、P38通路和ERK5通路等多条信号通路[39]。其中研究较多的为ERK1/2和P38信号通路。

研究发现白芍总苷可以抑制细胞中增殖相关基因Ki67和PCNA mRNA表达水平，并降低p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达[40]。李晓东[41]通过实验研究发现姜黄素能够上调软骨细胞的自噬水平，抑制IL-10诱导的软骨细胞凋亡，其作用机制与ERK1/2信号通路介导有关。

许骏等[42]探究补肾益肝活血方含药血清对骨关节炎模型鼠ERK/p38MAPK信号通路的影响，通过对SD大鼠灌药5 d制取含药血清，细胞传代培养，研究发现补肾益肝活血方可以明显降低IL-1β、TNF-α、ERK、p38MAPK的表达。这与补肾益肝活血方通过降低IL-1β和TNF-α炎症因子的表达，进而抑制细胞内的ERK1/2和p38MAPK等信号转导通路有关。

研究发现电针可通过调节关节软骨中Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2、C-MYC、C-FOS、C-JUN蛋白的表达，从而延缓骨关节炎软骨退变[43]。相应手法刺激也可以抑制ERK1/2信号通路的传导。在给予家兔髌骨按揉、关节被动屈伸等形式的手法治疗8周后，发现手法组软骨P38、ERK1/2及滑膜组织 IL-1β、iNOS、MMP-13的mRNA表达水平较模型组有明显的降低[44]。

3 激活信号通路的研究

3.1 PI3K/Akt信号通路

PI3K/Akt信号转导通路在软骨细胞凋亡过程中扮演者重要的角色。受体酪氨酸激酶的活化能够将PI3K激活，进而使AKT发生磷酸化，使其能够作用于TSC1/SC2发生解聚，解聚后的TSC1/TSC2最终激活mTOR及下游转录因子从而激活细胞凋亡相关基因的表达[45]。目前中医药对于PI3K/Akt 信号转导通路治疗研究多集中在炎症因子IL-1β、TNF-α和轴蛋白PI3K、Akt。

实验发现当归牛膝注射液可以抑制软骨细胞凋亡，当归牛膝组AKT的Thr308表位活化程度与正常组相同，证明了当归牛膝可以激活PI3K/Akt信号通路，抑制软骨细胞凋亡[46]。川芎提取物川芎嗪联合塞来昔布可改善早期膝骨关节炎大鼠血液高凝状态，降低软骨组织IL-6、IL-1β炎性因子水平，进一步上调软骨组织中p-PI3K和p-Akt蛋白含量，改善关节软骨病变[47]。

在实验研究中发现消肿止痛合剂可以明显下调TNF-α、IL-1β炎症因子的表达，并且同时使PI3K、AKT、Caspase-3 基因及蛋白表也显著降低，这与消肿止痛可减轻炎症因子的表达，减缓PI3K/Akt信号通路的细胞凋亡过程，从而达到保护关节软骨，延缓OA 病情进展的作用有关[48]。

张媛媛等[49]研究电针对于模型大鼠软骨细胞凋亡的影响，发现电针刺激可以提高Bcl-2表达，降低Bax表达，减少炎症因子IL-1β、TNF-α 生成，且这与电针刺激时间长短有着密切联系。

4 展望

骨关节炎的发生发展变化与炎症因子，氧化应激、细胞凋亡，细胞自噬等都有着密切的联系，且多与信号通路参与有关。正如本文中所提到的对于骨关节炎信号通路研究可分为抑制信号通路和激活信号通路两方面，然而对于激活信号通路的研究并没有大量实验为其佐证，这也为日后的研究提供了相应的参考。因中医药治疗的副作用小，临床疗效确定等优势性，使得近年来对于中医药对于骨关节炎信号通路作用机制探究也越来越多，虽然研究较多，但仍存在诸多问题有待考究，如目前对于骨关节炎的研究较多集中在Wnt/β-catenin和NF-κB信号通路和个别靶蛋白的研究上，然而对于PERK/Bip和Toll样受体信号通路及轴蛋白的研究仍然较少；在探究骨关节炎信号通路的作用机制中，中药复方研究仍占绝大多数，中药复方成分复杂性，仍是其缺乏有力的证据证明中医药对于骨关节炎的具体作用机制的问题所在。望今后研究学者多从中药单体药理学研究及信号通路的上下游蛋白着手，较多的开展信号通路的拮抗和协同作用研究，探讨较为确切的中医药治疗OA的作用机制。