基于网络药理学的威灵仙-急性子药对治疗食管癌的机制研究

程孟祺，胡佳奇,2，赵雨薇,2，郑红刚，花宝金

(1.中国中医科学院广安门医院, 北京 100053；2.北京中医药大学, 北京 100029)

食管癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，据2015年肿瘤登记数据显示[1]，我国每年新发食管癌24.6万例，死亡18.8万例，位居肿瘤死亡原因第4位。食管癌起病隐匿，早期主要表现为吞咽不畅感或胸骨后疼痛，待吞咽梗阻明显时多已进入中晚期，预后较差。在食管癌的治疗上，除了手术、放化疗等方法，中医药亦发挥了重要作用[2]，可有效改善患者症状、缓解放化疗不良反应、延长患者生存期。食管癌属中医学“噎膈”范畴，其病机多属虚实夹杂，以正气亏虚为本，气滞、痰阻、血瘀为标，治疗上注重权衡标本虚实，灵活选用理气化痰、消瘀散结之品[3]。威灵仙，性味辛、咸、温，归膀胱经，是治疗风湿痹痛，肢体拘挛，诸骨鲠喉的常用药，但亦常用于噎膈等症的治疗，正如《本草正义》所言：“威灵仙以走窜消克为能事，积湿停痰、血凝气滞，诸实宜之”。急性子，是凤仙花科植物凤仙花的干燥成熟种子，具有破血、软坚、消积之功。《本草纲目》言其主治“产难，积块，噎膈，下骨鲠，透骨通窍”。威灵仙、急性子二药均是中医临床治疗食管癌的高频用药[4]，二者常相须为用，可增强化痰活血、软坚散结之力，但两药配伍治疗食管癌的药效机制尚不明了，有待进一步阐明。

网络药理学作为一门从“多成分、多靶点、多途径”的系统层面揭示药物对机体调控作用的新兴学科，在推进中药现代化研究方面发挥了重要作用[5]。因此，本文运用网络药理学，对威灵仙-急性子药对治疗食管癌的活性成分、关键靶点、作用机制等进行初步探索，为后续研究提供依据与思路。

1 资料与方法

1.1 收集筛选威灵仙-急性子活性成分

在TCMSP数据库[6](http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集威灵仙、急性子的化学成分，按口服利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18进行筛选。同时，根据2015年版《中国药典》[7]中的药物含量测定项对成分进行补充，这部分活性成分虽不满足上述筛选标准，但在药材中含量较高，故亦纳入。

1.2 预测威灵仙-急性子活性成分潜在靶点

通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)收集威灵仙、急性子各活性成分对应的SDF格式的2D化学结构，并上传到Swiss Target Prediction平台[8](http://www.swisstargetprediction.ch/)，设置物种为人类，预测出威灵仙-急性子活性成分潜在靶点。

1.3 收集食管癌疾病靶点

通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)和DisGeNet数据库(https://www.disgenet.org/)收集食管癌(esophageal cancer)的相关靶点。在Genecards数据库中，Relevance score值越大则代表该靶点与疾病联系越密切，若靶点过多，参考相关文献[9]，选择筛选Relevance Score大于中位数的目标靶点为食管癌的潜在靶点。将以上3个数据库的靶点合并，删除重复值得到食管癌的潜在靶点。

1.4 获取药物与疾病的共同靶点

借助Venny 2.1 ( https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将药物活性成分与疾病作用靶点取交集，获得威灵仙-急性子药对治疗食管癌的关键靶点，绘制韦恩图。

1.5 构建“药物-活性成分-疾病-靶点”网络

为作图方便，将威灵仙、急性子以拼音首字母标记，各活性成分以拼音首字母加数字标记，二药共有成分以大写英文字母进行标记。在Cytoscape3.7.2中构建“药物-活性成分-疾病-靶点”网络。

1.6 构建关键靶点蛋白相互作用(PPI)网络

将1.4得到的关键靶点上传至String平台[10](Version 11.0, https://string-db.org/)，物种设置为“Homo sapiens”，置信度>0.9，其他参数设为默认值。将数据导入Cytoscape3.7.2，设置节点大小、颜色以反映连接度值(Degree)，构建PPI网络，根据Degree筛选核心靶点。

1.7 GO功能、KEGG通路富集分析

在Metascape在线平台[11](http://metascape.org/)上传关键靶点，设置P<0.01，进行GO分析[由细胞组成(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)、生物过程(biological process, BP)3部分组成]和KEGG分析，按P值升序排列，各选择前20条分析结果，通过OmicShare网站(https://www.omicshare.com/)分别绘制高级气泡图。

1.8 构建“活性成分-靶点-通路”网络

在Cytoscape3.7.2中导入威灵仙-急性子药对活性成分、前20条KEGG富集通路及对应的关键靶点，绘制“活性成分-靶点-通路”网络图。

2 结果

2.1 药物活性成分及靶点筛选

以OB≥30%、DL≥0.18为条件，在TCMSP数据库收集筛选威灵仙-急性子的活性成分，并结合2015版中国药典进行补充，其中威灵仙补充活性成分齐墩果酸，急性子补充凤仙萜四醇皂苷A、凤仙萜四醇皂苷K。研究共纳入威灵仙活性成分8种，急性子11种，其中共有成分2种，故最终纳入威灵仙-急性子药对活性成分17种，成分信息见表1。将Swiss Target Prediction数据库预测得到的靶点去重后，获得威灵仙活性成分作用靶点119个，急性子348个，合并去重处理后，得到威灵仙-急性子药对活性成分潜在作用靶点379个。

表1 威灵仙-急性子药对主要活性成分

2.2 食管癌靶点的获取及药物与疾病交集靶点的获取

在Genecards数据库中搜集食管癌靶点7 056个，考虑靶点基因过多，按Relevance Score分数由高到低进行排序，经两次筛选大于中位数的靶点后，获得1 766个靶点。结合Disgenet、TTD数据库补充食管癌靶点，合并去重，共获得疾病靶点2 396个。在Venny2.1.0中将筛选出的威灵仙-急性子活性成分靶点与食管癌靶点取交集，得到178个共同关键靶点，见图1。

图1 威灵仙-急性子活性成分与食管癌靶点的韦恩图Fig 1 Venn diagram of active components of Radix Clematidis - Impatientis Semen and targets of esophageal cancer

2.3 “药物-活性成分-疾病-靶点”网络的建立

运用Cytoscape3.7.2构建“药物-活性成分-疾病-靶点”网络，见图2。本网络由198个节点和638条边构成，节点对应的标记见表1。采用Cytoscape软件内置的Network Analyzer工具计算节点的度值(Degree)大小。节点度值越大，说明在在网络中越重要。其中槲皮素(Degree=65)、山柰酚(Degree=63)、花生四烯酸甲酯(Degree=53)、3-表齐墩果酸(Degree=43)、齐墩果酸(Degree=42)，位居前5位。

图2 “药物-活性成分-疾病-靶点”网络图Fig 2 Network diagram of “drug-active components-disease-target”

2.4 威灵仙-急性子药对治疗食管癌的关键靶点PPI网络

在String 11.0平台上传178个关键靶点，将置信度高于0.9的数据导入至Cytoscape3.7.2，绘制PPI网络图，见图3。该PPI网络由144个节点和661条边构成，节点越大，颜色越深，连线越密集，则地位越重要。节点度值前5的靶点为PIK3CA、PIK3R1、SRC、MAPK1、MAPK3，分别对应48、44、42、37、34，提示这些靶点可能是威灵仙-急性子药对治疗食管癌的核心靶点。

图3 PPI网络图Fig 3 PPI network diagram

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

通过Metascape在线平台对威灵仙-急性子药对活性成分治疗食管癌的关键靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，共有2 304个GO术语条目，其中细胞组成116个，分子功能187个，生物过程2 001个，KEGG富集显示143条通路。按P值排序后，取前20条通过Omicshare平台转化为高级气泡图，见图4～7。

图4 威灵仙-急性子药对治疗食管癌关键靶点的GO CC分析Fig 4 GO CC analysis of Radix Clematidis - Impatientis Semen on key targets for the treatment of esophageal cancer

图5 威灵仙-急性子药对治疗食管癌关键靶点的GO MF分析Fig 5 GO MF analysis of Radix Clematidis - Impatientis Semen on key targets for the treatment of esophageal cancer

图6 威灵仙-急性子药对治疗食管癌关键靶点的GO BP分析Fig 6 GO BP analysis of Radix Clematidis - Impatientis Semen on key targets for the treatment of esophageal cancer

图7 威灵仙-急性子药对治疗食管癌关键靶点的KEGG通路富集分析Fig 7 KEGG pathway enrichment analysis of Radix Clematidis - Impatientis Semen on key targets for the treatment of esophageal cancer

GO功能富集分析结果显示，细胞组成主要集中于受体复合物(receptor complex)、膜筏(membrane raft)、膜微域(membrane microdomain)等部位，见图4；分子功能主要集中于蛋白激酶活性(protein kinase activity)、以醇基为受体的磷酸转移酶活性(phosphotransferase activity, alcohol group as acceptor)、激酶活性(kinase activity)等方面，见图5；生物过程主要集中于丝裂原活化蛋白激酶级联的正向调节(positive regulation of MAPK cascade)、转移酶活性的正向调节(positive regulation of transferase activity)、激酶活性的正向调节(positive regulation of kinase activity)等方面，见图6。

KEGG通路富集分析结果显示，癌症通路(Pathways in cancer)、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌症中心碳代谢(Central carbon metabolism in cancer)、癌症蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)等20条通路与威灵仙-急性子治疗食管癌可能相关，见图7。根据以上KEGG通路富集结果，并结合文献查阅，筛选出与食管癌相关的通路，涉及PI3K-Akt、Rap1、Ras、VEGF等信号通路。

2.6 “活性成分-靶点-通路”网络图

将威灵仙-急性子药对活性成分、前20条KEGG富集通路及对应的关键靶点导入Cytoscape3.7.2，绘制“活性成分-靶点-通路”网络图，其中绿色V形节点代表通路，圆形节点代表药物活性成分，蓝色方形节点代表关键靶点，见图8，对应标记见表1。该网络图反映出威灵仙-急性子药对治疗食管癌“多成分、多靶点、多通路”的调控特点。

图8 “活性成分-靶点-通路”网络图Fig 8 Network diagram of “active component-target-pathway”

3 讨论

研究表明，食管癌最常见的两个中医证型是气滞血瘀证及痰瘀互结证[12]。威灵仙、急性子作为理气化痰、消瘀散结的经典组合，是治疗食管癌的常用药对[13]，对控制肿瘤进展、缓解噎膈症状具有重要意义。根据药理研究结果，威灵仙提取物对舌鳞癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞等的生长均具有抑制作用[14, 15]。急性子包含脂肪油、黄酮、萘醌类、皂苷类等多种化学成分，其提取物对肺癌、乳腺癌等癌细胞的增殖有不同程度的抑制作用[16]。但目前尚缺乏威灵仙、急性子治疗食管癌的相关实验研究，故在此运用网络药理学进行初步探讨。

本研究共筛选出威灵仙-急性子药对活性成分17个，关键靶点178个。经“药物-活性成分-疾病-靶点”网络分析可知，槲皮素、山柰酚、花生四烯酸甲酯、3-表齐墩果酸、齐墩果酸可能是威灵仙-急性子药对治疗食管癌的关键活性成分。既往基础研究表明[17-20]，槲皮素可以抑制人食管癌Eca-109细胞的增殖、侵袭、迁移及血管新生，促进凋亡，诱导癌细胞自噬以加强抗增殖作用，并可通过抑制NF-κB增强化疗疗效。山柰酚属于黄酮类化合物，李瑞君等[21]研究发现，山柰酚能够抑制食管鳞癌细胞增殖，并可能通过线粒体途径诱导癌细胞凋亡。3-表齐墩果酸、齐墩果酸均属五环三萜类化合物，可调控多条信号通路抑制肿瘤的进展[22]。有研究表明[23, 24]，齐墩果酸等三萜类化合物在一定浓度范围内能明显抑制食管癌细胞的增殖，并且增强5-氟尿嘧啶等化疗药物抗食管癌的疗效。对于花生四烯酸甲酯，目前暂无相关实验研究，可能是威灵仙-急性子药对治疗食管癌的又一发现，有待进一步验证。

根据PPI网络可知，威灵仙-急性子药对的活性成分主要通过作用于PIK3CA、PIK3R1、SRC、MAPK1、MAPK3等核心靶点发挥作用。PIK3CA基因和PIK3R1基因分别编码组成PI3K蛋白(磷脂酰肌醇3-激酶)的p110催化亚基和p85调节亚基，故两者的突变或激活均可以激活PI3K蛋白，引起PI3K-Akt信号通路活化，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[25]。有研究表明[26]，PI3K3CA可促进食管鳞癌细胞的增殖、迁移，抑制其凋亡。SRC基因编码非受体酪氨酸激酶，在包括食管癌的多种肿瘤中都呈现过表达或持续激活状态，促进肿瘤的生长和转移[27, 28]。MAPK1又称ERK2，编码细胞外信号调节激酶2，MAPK3又称ERK1，编码细胞外信号调节激酶1，两者是ERK信号通路的重要组件，其过度激活与肿瘤的发生发展及耐药的形成关系密切[29]。相关研究发现[30, 31]，磷酸化的ERK1/ERK2能够促进食管癌细胞的增殖、侵袭和转移，其机制可能与调控癌细胞上皮间质转化及血管拟态形成有关。

通过KEGG通路富集分析及相关文献查阅可知，威灵仙-急性子药对治疗食管癌主要涉及PI3K-Akt、Rap1、Ras、VEGF等信号通路。PI3K-Akt信号通路是最常见的肿瘤信号通路之一，该通路的异常激活与肿瘤的发生、发展及耐药密切相关[32]，在食管癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等方面发挥着重要作用[33]，有研究表明[34]，其能够促进食管癌组织微淋巴管的生成和淋巴结转移。Rap1信号通路可调控细胞黏附、细胞迁移、细胞极性形成、血管生成等多种细胞活动，与肿瘤的发生、发展存在密切联系[35]。Rap1通路通过多种方式介导细胞外张力增加的影响，从而促进肿瘤细胞的生长[36]。Rap1b是Rap1的一种亚型，在食管鳞癌中表达上调，可促进肿瘤的侵袭与转移[37]。调查研究显示，Ras基因突变大约存在于30%的癌症患者体内，Ras通路是参与调控细胞增殖、分化和凋亡的重要通路，在食管癌的发病过程中扮演重要角色[38-40]。血管内皮生长因子(VEGF)通路是促进肿瘤血管新生作用最强的调控通路之一[41]，而实体肿瘤的进一步生长、浸润及转移都离不开新生血管的形成，VEGF在食管癌组织中高表达，与食管癌的侵袭、转移及预后等密切相关[42]，抑制VEGF的过表达，阻断VEGF通路，是治疗的关键。

综上所述，基于网络药理学方法，本研究发现威灵仙-急性子药对中的槲皮素、山柰酚、3-表齐墩果酸、齐墩果酸等主要活性成分可能通过PI3K-Akt、Rap1、Ras、VEGF等信号通路作用于PIK3CA、PIK3R1、SRC、MAPK1、MAPK3等食管癌核心靶点，发挥了抗肿瘤增殖、促肿瘤凋亡、抑制新生血管生成、预防淋巴转移等作用，体现了中药“多成分、多途径、多靶点”的调控特点，为后续实验研究提供了依据与思路，有待进一步的科学验证。