肝损伤引起视网膜及血-视网膜屏障的结构功能变化及可能机制研究进展

2021-04-17于丝雨刘李刘晓东中国药科大学药学院南京211100

中南药学 2021年2期

于丝雨，刘李，刘晓东（中国药科大学药学院，南京 211100）

视网膜是人眼内最重要的结构之一。视网膜内部结构及血-视网膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的存在利于视网膜稳态的维持。视网膜电位图（electroretinogram，ERG）是临床上常用的检查视网膜功能的诊断工具，肝损伤患者ERG 表明其振荡电位、a 波和b 波均有不同程度的降低和延迟，其改变程度与肝性脑病程度和肝纤维化程度成正相关，说明肝损伤状态下视网膜功能出现异常。动物实验显示硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）诱导肝损伤和胆管结扎（bile duct ligation，BDL）诱导肝损伤均可引起视网膜病变，提示肝损伤状态下视网膜结构和功能发生变化，但在不同形式的肝损伤状态下，肝性视网膜病变的致病机制均有所不同[1]。本文综述视网膜及BRB 的组织结构与功能，重点综述几种不同形式的肝损伤状态下视网膜及BRB 结构功能变化及可能机制。

1 视网膜与血-视网膜屏障

1.1 视网膜组织结构

组织学上，可将视网膜大体分为两层，即视网膜色素上皮层（retinal pigment epithelium，RPE）和视网膜神经感觉层（可细分为外限膜、外核层、外丛状层、内核层、内丛状层、神经节细胞层、神经纤维层及内限膜）；其中RPE、内限膜、外限膜及Müller 细胞在某些物质由玻璃体向视网膜转运过程中起直接屏障作用[1]。Müller细胞是脊椎动物视网膜中的主要神经胶质细胞，其参与构成BRB，对维持视网膜正常结构和功能有重要作用[2]。

1.2 血-视网膜屏障组织结构

血眼屏障由两大主要部分构成，即前血-房水屏障和后血-视网膜屏障[3]。BRB 主要由视网膜毛细血管内皮细胞及其连接构成内屏障，星形胶质细胞及Müller 细胞的突起包绕其外，参与构成内屏障；由色素上皮细胞及其连接构成外屏障。

BRB 上有多种转运蛋白表达。转运蛋白可分为两大家族，即溶质载体（solute carrier，SLC）超家族和ATP 结合盒（ATP-binding cassette，ABC）超家族。在人的BRB 上表达的SLC 超家族转运体包括谷氨酸转运体、神经递质类转运体、一元羧酸类转运体、核苷转运体等，ABC 超家族转运体包括多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated proteins，MRPs）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）及乳腺癌耐药蛋白等[4-6]。

1.3 血-视网膜屏障的功能

BRB 构成的结构性屏障可限制亲水性物质由血液至神经视网膜侧的非特异性转运。Occludin、ZO-1 是其中代表性的紧密连接蛋白，它们参与构成细胞旁屏障，具有调节物质转运的功能，常作为评价紧密连接屏障功能及屏障通透性的指标[7-8]。

BRB 也具有一定的通透性。构成BRB 的视网膜内皮细胞和RPE 细胞上表达有多种特殊转运体，可将某些重要的营养物质高效地由循环血液转运至视网膜侧，同时将某些内源性、外源性物质选择性地外排至视网膜外[6]。BRB 上也表达有其他氨基酸类转运体[9]，具有转运左旋多巴[10]、谷氨酸[11]等物质的功能，其他摄取转运体如一元羧酸转运体、核苷转运蛋白也对某些底物在BRB 的转运过程具有重要作用[5]。

1.4 影响血-视网膜屏障功能的因素

BRB 功能受多种因素影响，缺血、缺氧、渗透压改变、某些内源性物质及化学物质均会影响屏障结构和功能[12]，特别是BRB 上转运体的功能与表达水平变化可直接对视网膜屏障功能产生影响。

1.4.1 BRB 上转运体对视网膜屏障功能的影响除具有转运营养物质和内源性废物的功能，BRB上也有多种具有不同生理功能的转运体和通道表达。多项研究表明P-gp 具有主动外排功能[5，13]，且在人视网膜色素上皮细胞系及人原代RPE 细胞中有外排转运蛋白MRP 存在[14-15]。另一类是摄取转运体，如人RPE 细胞上表达有Na＋-依赖的谷氨酸转运体家族[16]、Na＋-Cl－依赖的神经递质类转运体[5]、氨基酸转运载体[17]；在转基因大鼠视网膜毛细血管内皮细胞上表达有对半胱氨酸的摄取具有饱和性且受底物氨基酸抑制的谷氨酸/半胱氨酸交换转运体[18]等。

1.4.2 氧化应激对视网膜屏障功能的影响氧化应激变化可通过多种机制影响细胞进程。早期用过氧化氢处理BRB 所得的研究结果包括肌动蛋白的重组、细胞间连接蛋白的再分布、RPE 屏障通透性的增加等[19-22]。

1.4.3 某些细胞因子对视网膜屏障功能的影响在糖尿病性视网膜疾病状态下，其代谢功能异常通常会导致某些细胞因子如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、白介素的生成异常增多，进而导致血管系统内白细胞增多，发生血管堵塞、周细胞和内皮细胞的丢失，使血管通透性增加，从而引发黄斑水肿[23-25]。特别是由VEGF 激活蛋白激酶C 引起Occludin 磷酸化水平变化，进而导致Occludin 蛋白迁移，而后期因Occludin 磷酸化导致的Occludin 蛋白含量降低会使视网膜屏障功能受到进一步的损伤[26]。

2 肝损伤对视网膜屏障功能的影响及可能机制

研究发现，某些死于肝损伤（包括肝性脑病）的患者其视网膜Müller 细胞发生了形态学变化，这种变化与肝性脑病患者脑内胶质细胞（阿尔茨海默-Ⅱ型星形胶质细胞）形态学变化相似[1，27]，因此将肝损伤状态下的视网膜病变定义为肝性视网膜疾病。实验对11 名患肝硬化（由不同种肝疾病发展而来）并伴有肝性脑病的患者分别进行眼部常规检查、色彩辨认测试及标准视网膜电位测定。实验结果总结如下[1]：

① 病情严重患者暗适应、明适应条件下a 波及b 波均表现为振幅显著下降，潜伏期延长，且患者振荡电位的振幅显著缩小，潜伏期显著延长[1，28]。a 波反映感光细胞电位水平，b 波主要反映双极细胞对视觉冲动的传导情况及Müller 细胞电位水平，振荡电位主要反映无长突细胞电位水平[29]。

② 病情严重患者出现蓝-黄颜色识别障碍、视敏度降低、黄斑反射异常甚至消失、RPE 层细颗粒状改变现象[1]。

因此，为研究此种由肝损伤引起的视网膜结构和功能障碍及可能机制，以下将介绍两种常用肝损伤模型及一种外源性诱导视网膜病变状态下，视网膜及BRB 结构和功能变化的可能机制。

2.1 硫代乙酰胺诱导的肝损伤状态下视网膜屏障功能变化及可能机制

首先以大鼠为研究物种，研究TAA 诱导的肝损伤大鼠视网膜免疫形态学及超微结构变化。光学显微镜下，肝损伤大鼠视网膜Müller 细胞细胞质肿胀。在免疫组织学水平上，通过对肝损伤大鼠视网膜Müller 细胞胶质特异性标记蛋白进行免疫染色，同对照组相比，在光学显微镜下可发现在视网膜Müller 细胞末梢和玻璃体干细胞突起处表现为视网膜胶质纤维酸性蛋白阳性，肝损伤大鼠视网膜Müller 细胞内谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）免疫反应性明显增强，具有GS 标记的细胞末梢范围增大[27]。在超微结构上，肝损伤大鼠视网膜Müller 细胞突起空泡化，特别是细胞末梢含有许多肿胀的线粒体[30]。此外，分别给予亚毒性至毒性剂量的NH4＋，体外培养的正常Müller 细胞也表现出与上述相近的一系列免疫组织学和超微结构变化[31]。对于TAA 诱导的肝损伤引起视网膜Müller 细胞免疫形态学及超微结构变化的机制已有诸多研究[27-32]：

① 研究发现对于培养的家兔Müller 细胞，给予氨水平（NH4＋）的剂量升高会伴有视网膜GS 免疫反应性的增强，这与从TAA 诱导的肝损伤大鼠上获得的结果一致。小鼠视网膜星形胶质细胞若暴露于兴奋性氨基酸（包括谷氨酸）下，会刺激GS 活性。而GS 活性的增强可能与谷氨酰胺合成增多密切相关。

② 在大鼠视网膜内释放谷氨酸的细胞数量减少，感光细胞变性的情况下，Müller 细胞会下调GS 表达水平。

③ 脑内胶质细胞肿胀是急性肝性脑病特征之一，且在暴露于高浓度氨的Müller 细胞和TAA 诱导的肝损伤小鼠Müller 细胞上均可观察到细胞肿胀，其可能与黄斑反射的消失有关[31-32]。

④ Müller 细胞是视网膜内唯一具有将谷氨酸转化为谷氨酰胺功能的细胞，在急性氨升高条件下，大鼠星形胶质细胞内谷氨酰胺浓度升高，且大鼠星形细胞谷氨酸净摄取量及最大摄取速度提高。其中Müller 细胞内谷氨酰胺浓度升高与渗透性水内流及细胞肿胀密切相关。

因此，由以上诸多研究可以推断TAA 诱导的肝损伤大鼠眼部发生变化的原因：TAA 诱导的肝损伤大鼠血清氨浓度升高，Müller 细胞暴露于高浓度氨供应条件下时，其可能通过某种底物调节机制上调GS 的表达或活性，促进氨和谷氨酸转化为谷氨酰胺（这可能是Müller 细胞内谷氨酰胺合成增多的原因），进而导致细胞形态学发生变化，发生细胞肿胀和细胞突起空泡化。

另有研究发现，Müller 细胞损伤可能会通过影响视色素代谢使感光细胞应答和a 波振幅减弱[33]。Müller 细胞内存在细胞视网膜连接蛋白和视黄醇连接蛋白，因此推测在正常视网膜内，Müller 细胞参与视色素的合成与再生循环[33]，当Müller 细胞受损时，此过程将受到影响。另外由于视网膜活动神经元的能量代谢依赖于Müller 细胞与神经元的共生，因此Müller 细胞功能障碍会导致神经元代谢继发性障碍和神经信息处理中断[1]，最终引起视网膜功能障碍。

2.2 胆管结扎诱导的肝硬化状态下视网膜屏障功能变化及可能机制

研究发现BDL 组小鼠出现胆汁淤积现象，与假手术组和对照组小鼠相比，BDL 组小鼠视网膜神经节细胞层厚度显著增加，视网膜形态发生变化，其他视网膜层（外核层、外丛状层、内核层、内丛状层）厚度无明显变化[34]。相比于BDL 组，BDL 诱导的肝硬化小鼠给予纳曲酮（naltrexone，NTX）后小鼠视网膜神经节细胞厚度显著降低，且与假手术组和对照组相比无显著性差异。另有实验表明假手术组日常给予NTX注射不会引起小鼠视网膜神经节细胞层厚度增加[34]。由此可以推断内源性阿片类物质的生成增多可能与BDL 小鼠视网膜神经节细胞层厚度过度增加有关。早期研究表明视网膜上表达有多种特定类型的阿片类受体，另有研究发现阿片类物质可影响神经节细胞层的活性，且内源性阿片类物质具有调节处于生长状态大鼠视网膜内细胞增殖的作用[35]。

以上研究结果表明，小鼠视网膜形态学变化可能由BDL 诱导的肝硬化小鼠影响正常的阿片类物质代谢，进而阿片类物质激活视网膜上特定的某种或某几种阿片类受体，使视网膜神经节细胞过度增殖，最终导致视网膜神经节细胞层厚度增加。另有研究发现，糖尿病视网膜病变状态下，视网膜神经节细胞层厚度也显著增加[36]。目前还未有研究表明神经节细胞层厚度的增加对视网膜及BRB 功能是否有直接影响，推测视网膜神经节细胞层厚度增加可能会使视网膜厚度增加，影响视网膜及BRB 的多种功能。

2.3 肝炎病毒诱导的视网膜屏障功能障碍及可能机制

一项临床研究结果显示，在患有丙型病毒性肝炎的患者群组内视网膜疾病的发病率显著高于对照组[37]，因此丙型病毒性肝炎与视网膜疾病发生之间的关系有待研究。

研究表明，鼠肝炎病毒以玻璃体内接种途径感染白变种实验室小鼠会引发急性或慢性的眼部病变。在感染第一阶段（1～7 d）可观察到视网膜血管炎症产生，并伴有病毒蛋白和侵染性病毒的存在；第二阶段（10～140 d）视网膜内病毒蛋白和侵染性病毒消失，动物血清内发现存在抗病毒中和抗体，视网膜血管炎症消失，视网膜退行性改变，包括感光细胞层减少、感光细胞间连接蛋白丢失、RPE 异常、视网膜脱落等，进而导致视网膜屏障功能受损。这种退行性变化可能与抗视网膜和抗RPE 细胞自身抗体的生成有关。且在第一阶段及第二阶段，神经视网膜（神经节细胞层、Müller 细胞内等）及RPE 层均存在病毒RNA。研究发现在动物肝组织中也检测到相似的病毒类型，表明病毒诱导的视网膜病变与系统性持久性病毒感染密切相关[38]。

RPE 细胞不仅具有调节视网膜生理结构稳定的作用，且具有重要免疫作用。RPE 细胞可生成主要组织相容性复合体，其可呈递外源性病毒蛋白及视网膜蛋白给辅助T 细胞，从而诱导免疫反应的发生；视网膜内病毒RNA 的持续存在可启动自身免疫反应，进而造成免疫性损伤[38]。因此，在肝炎病毒诱导的视网膜病变状态下，病毒RNA 及低水平病毒蛋白的存在与视网膜内多种病理学过程包括视网膜屏障功能障碍相关联。