猪瘟病毒感染过程中非结构蛋白作用的研究进展

杨志刚，汤德元，廖少山，张森，韩超逸，晏仁潭

(贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

CSFV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivurts)，其完整的病毒粒子呈球型，直径为38～50 nm，核衣壳呈立体对称的二十面体结构，直径约为29 nm，病毒囊膜表面延伸出许多长为6～8 nm含糖蛋白的纤突结构。CSFV为单链正链RNA病毒，基因组约为12.3 kb，含有一个开放阅读框编码大约3 898个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白经病毒蛋白酶和宿主蛋白酶裂解为12种成熟蛋白，包括4种结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[1]。相关研究证明，CSFV非结构蛋白在其感染致病过程中发挥重要调控作用，CSFV各主要蛋白协同促进了疾病的发展进程。因此，本文对CSFV感染过程中各非结构蛋白的相关调控作用机制进行了综述。

1 Npro蛋白

Npro蛋白是 CSFV编码的第一个蛋白，分子量大小约为23 kDa，由168个氨基酸残基组成。Npro在抑制I型和III型干扰素、促进CSFV复制、提高病毒毒力以及抗细胞凋亡等方面发挥着重要的作用。

在逃避宿主先天免疫方面，Npro能抑制宿主中I型和III型干扰素的产生。有研究表明，Npro可以通过蛋白酶体途径降解IRF3以及与IRF7相互作用，从而降低I型干扰素的产生，进而来逃避先天免疫[2]，并协同病毒复制，从而增强了CSFV的致病性[3]。随后，Gottipati等[4]将IRF3和重组纯化的CSFV Npro置于缓冲液中直接进行反应，发现Npro能够直接结合IRF3单体和二聚体，并且不依赖其活性状态。Cao等[5]研究发现Npro通过抑制IRF1表达及其核易位进而抑制III型干扰素的产生。

Npro与病毒毒力有关，且在抗细胞凋亡和促进CSFV生长方面发挥作用。Mayer等在2004年发现缺乏Npro的CSFV突变体在体外和体内都被减毒，证明Npro与CSFV的毒力有关。之后，Li等[6]表达位于细胞质中的IRF3-Npro融合蛋白的突变体vSM-IRF3，并发现由于Npro核定位的破坏，vSM-IRF3在体外和体内毒力明显减弱，证明了上述观点，同时还发现Npro的核定位对于细胞中的有效复制至关重要。Johns等[7]为了阐明Npro的功能机制，进行了酵母双杂交筛选，其中鉴定了抗凋亡蛋白HAX-1，通过共沉淀试验证实Npro-HAX-1相互作用，在共转染的细胞以及用野生型CSFV感染的转染细胞中观察到HAX-1，而在Npro缺失的CSFV感染细胞中未观察到HAX-1，结果证明Npro通过与HAX-1相互作用，在抑制RNA诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。Li等[8]发现poly(C)结合蛋白1(PCBP1)为CSFV Npro的新型相互作用蛋白，敲除PCBP1抑制了CSFV生长，而PCBP1的过度表达促进了CSFV生长，此外，I型干扰素被PCBP1和Npro下调，结果表明PCBP1正向调节CSFV的生长。

2 p7蛋白

P7蛋白是一种病毒孔蛋白，分子量大小约为7 kDa，由64个氨基酸残基构成。研究表明，P7蛋白在病毒复制、孔形成、病毒毒力、改变细胞膜通透性等方面起着重要作用。Gladue等[9]研究发现p7的同框删除对病毒生长有害，这表明p7对于细胞培养中的病毒复制至关重要；相对于高毒力的CSFV Brescia株，p7突变病毒在猪中部分或完全减毒，表明p7在CSFV毒力中具有重要作用；模拟内质网脂质组成的模型膜中的结构功能分析证实，p7是一种成孔蛋白，并且成孔活性驻留在C端跨膜螺旋中。之后，Guo等[10]研究发现在大肠杆菌或哺乳动物细胞中表达p7，导致细胞膜的通透性增加，在早期主要定位在ER上，而后期转移到细胞膜上，缺失分析表明41～63氨基酸对于其孔蛋白的活性是必需的，以及Largo等[11]发现p7可以在ER的双层膜结构模仿物上形成离子通道，并且该通道可以通过分子量为427.33的ANTS分子，这都证明了上述p7是一种成孔蛋白这一观点。Zhao等[12]研究表明单独的P7蛋白及其前体 E2-P7 蛋白复合体在调节蛋白相互作用和促进CSFV增殖的过程中起到重要作用，而不会影响病毒复制，这对上述p7对细胞培养中的病毒复制至关重要这一观点进行了进一步证明。

3 NS2蛋白

NS2 蛋白由457个氨基酸残基构成, 具有蛋白酶活性，能将NS2-3蛋白复合体切割形成NS2和NS3 2个单体蛋白，还能够调节细胞生长、细胞周期进程和细胞凋亡，为病毒复制提供有利的环境。研究发现，含有完整NS2-NS3基因的RNA复制子在转染的细胞中持续存在并继续复制，不会对细胞造成任何明显的形态或功能损害，而缺少NS2基因的基因组则能够更有效地复制并引起细胞病变作用，这些发现表明NS2尽管对于RNA复制不是必需的，但是在其中具有一定的调节功能。之后，Li等[13]突变了CSFV NS2 N末端的几个代表性保守残基，并研究了这些突变如何影响病毒RNA复制和感染性病毒的产生，结果表明在NS2的N端2个天冬氨酸NS2/D60A或NS2/D60K和NS2/D78K的突变消除了感染性病毒的产生，并且在100位(NS2/R100A)用精氨酸代替丙氨酸导致病毒滴度显著降低，含有病毒基因组RNA分子的细胞的连续传代产生了回复株NS2/A60D、NS2/K60D和NS2/K78D，感染性病毒得到恢复，这些结果揭示了CSFV NS2 N末端能调节病毒复制，证明了上述观点。Tang等[14]建立了稳定的表达CSFV NS2的猪脐静脉内皮细胞系(SUVEC)，并发现该蛋白定位于内质网(ER)，细胞分析显示，由于S期细胞周期停滞，表达NS2的细胞系的复制被抑制20%～30%，NS2还诱导内质网应激和激活NF-κB，这些结果证明了NS2诱导S期阻滞来调节细胞生长和细胞周期进程，从而为病毒复制提供有利的细胞环境，又进一步发现NS2的表达诱导内质网应激和激活NF-κB之后，从而上调IL-8和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并抑制MG132诱导的细胞凋亡，数据表明CSFV NS2在炎症反应和持续感染中起重要作用[15]。此外，Kang等[16]利用酵母双杂交分析出MOAP1、DNAJA1、GOPC、FANCL、TMED4和CSDE1可以与NS2相互作用，这些蛋白质主要与凋亡、应激反应、氧化还原、代谢有关，但具体作用有待进一步研究。

4 NS3蛋白

NS3蛋白分子量大小约为80 kDa，由683个氨基酸残基构成，具有核苷三磷酸酶活性、丝氨酸蛋白酶活性和核糖核酸解旋酶活性，它们是转录和翻译所必需的。研究表明，NS3具有解旋酶活性，在CSFV基因组复制发挥重要作用，并且NS3蛋白酶结构域和NS5B能够调节NS3的核苷三磷酸酶活性和解旋酶活性。此外，NS3与肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)相互作用，降解了TRAF6，通过NF-κB信号通路促进CSFV复制[17]；NS3与TRAF5相互作用促进了TRAF5的表达，而TRAF5的表达又激活p38 MAPK，从而促进了CSFV复制[18]。近期的研究还发现宿主细胞蛋白PSMB10通过泛素-蛋白酶体途径降解NS3蛋白，从而抑制经典猪瘟病毒的生长，这可能为猪瘟的治疗提供一定的思路[19]。

5 NS4A蛋白

NS4A蛋白分子量大小约为6 kDa，由64个氨基酸残基组成，是NS2-3蛋白的辅助因子，在病毒的复制和病毒颗粒组装中发挥重要作用。最近，Wang等[20]发现CSFV感染通过MAVS途径诱导猪脐静脉内皮细胞表达和分泌IL-8，还证明了NS4A定位于细胞核和细胞质，且通过增强MAVS途径诱导IL-8的产生，并促进CSFV复制。

6 NS4B蛋白

NS4B蛋白分子量大小约为38 kDa，由347个氨基酸残基组成，有2个保守的结构域，分别是WalkerA(209～216 aa)和WalkerB(335～342 aa)，具有NTPase活性，能与非结构蛋白(即NS3、NS4A、NS5A和NS5B)一起形成RNA复制复合物，在病毒复制、毒力、抗细胞凋亡等方面发挥重要作用。研究发现，WalkerA对NTPase活性至关重要。Tamura等[21]研究表明NS4B对病毒的毒力有影响，可以与E2通过协同作用提高病毒的致病性，之后又进一步发现NS4B N末端结构域介导的细胞内膜结合可以决定细胞培养中的CSFV基因组复制和猪的病毒致病性[22]。

研究发现，NS4B可以与多种蛋白相互作用并发挥作用。Lin等[23]证明Rab5与NS4B相互作用以促进NS4B相关复合物的形成并增强CSFV增殖；Qian等[24]发现铁蛋白重链(FHC)(一种著名的抗凋亡蛋白)是一种与NS4B相互作用的蛋白，可增强CSFV复制，并通过调节调节细胞活性氧(ROS)来抵消细胞凋亡；研究人员[25]通过酵母双杂交(Y2H)系统筛选、亚细胞共定位、共免疫沉淀和谷胱甘肽S-转移酶下拉分析证明了坦克结合激酶1(TBK1)是NS4B相互作用的细胞蛋白，但具体作用有待进一步研究。最近，Zhang等[26]研究发现猪RING指蛋白114(pRNF114)(一种RING域E3泛素连接酶)是潜在的抗CSFV因子，pRNF114通过靶向并催化NS4B蛋白的K27连接的多聚泛素化，然后促进蛋白酶体依赖性的NS4B降解，从而抑制CSFV的复制，这为开发猪瘟的治疗方法提供新的思路。

7 NS5A蛋白

NS5A蛋白分子量大小约为55 kDa，由496个氨基酸残基组成，是一种磷酸化的多功能蛋白，能抑制NF-κB信号通路和诱导宿主细胞的自噬，在调节病毒复制方面发挥重要作用。研究发现，NS5A蛋白定位于内质网，通过N和C端结构域刺激病毒复制和抑制病毒翻译。之后，Chen等[27]研究发现NS5A可以通过与NS5B和3'UTR结合而调节病毒的复制，当无法与NS5B结合时，NS5A仍可以通过与3'UTR结合来调节病毒的合成，同时，Sheng等[28]发现当细胞中NS5A的水平较低时，NS5A与NS5B一起结合3′UTRSL-1，促进病毒复制；而当NS5A水平较高时，NS5A蛋白除了结合3′UTRSL-1之外，还结合3′UTRSL-2，正是NS5A与3′UTRSL-2的结合可能抑制了NS5B以相同的3′UTR为模板的病毒合成，这对上述观点进行了进一步解释。此外，Xie等[29]研究表明NS5A可以切割形成两科个截断形式的b和c，通过蛋白酶抑制剂和shRNA干扰的实验表明，caspase6蛋白酶介导形式c的切割，另一种未知蛋白酶介导形式b的切割，下调或抑制该蛋白酶的活性显著的降低了基因组复制和病毒产生，证明NS5A的切割有利于病毒的复制。

研究表明，NS5A通过诱导宿主细胞的自噬和抑制NF-κB信号通路，从而促进病毒的复制和成熟。Pei等[30]研究发现CSFV通过诱导宿主细胞的自噬途径从而促进病毒的复制和成熟，免疫电子显微镜检查进一步证实了E2和NS5A蛋白与自噬小体样囊泡的共定位，所以NS5A可能对CSFV诱导自噬具有重要意义，但其机制尚待阐明。Dong等[31]发现在猪肺泡巨噬细胞中，CSFV NS5A通过抑制NF-κB信号通路抑制poly(I：C)诱导的炎症细胞因子分泌，这可能有助于寻找新的方法来预防CSFV感染。

NS5A能与宿主细胞中多种蛋白发生相互作用，从而增强病毒复制，同时也发现一些蛋白能与NS5A相互作用，从而抑制病毒复制，这可能有助于开发新的方法来治疗CSFV感染。Zhang等[32]研究发现热激蛋白70与CSFV NS5A的N末端氨基酸(29240)蛋白相互作用，并增强病毒复制；Li等[33]研究发现FKBP8和CSFV NS5A相互作用，并促进病毒复制；Liu等[34]研究表明真核生物翻译起始因子3亚基E(eIF3E)与CSFV NS5A相互作用，并促进病毒复制。Li等[35]发现真核延长因子1A(eEF1A)与CSFV NS5A蛋白相互作用，并抑制病毒的生长；Ling等[36]研究发现热休克蛋白27(Hsp27)与CSFV NS5A相互作用，并通过NF-κB信号通路抑制病毒复制；毒蛇毒蛋白通过与CSFV NS5A相互作用，并抑制病毒复制[37]。

8 NS5B蛋白

NS5B分子量大小约为82 kDa，由718个氨基酸残基组成，是一种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，负责病毒基因组的复制。Xiao等[38]研究发现NS5B蛋白通过3′UTR与正链结合形成复合物，从而促进CSFV复制，且发现CSFV正链RNA的3′UTR“CCCGG”序列和负链RNA 3′UTR“CATTGCTC”序列是正链RNA和负链RNA合成必需的。Li等[39]研究结果进一步表明CSFV核心蛋白通过CSFV NS5B调节RNA的合成。此外，其他非结构蛋白与NS5B之间的相互作用在病毒的生命周期中发挥了重要作用。例如，Wang等[40]研究发现CSFV NS3通过与NS5B结合增强RdRp活性，也调节NS3的 NTP酶活性和解旋酶活性，之后，又进一步发现NS5B包含2个NS3结合位点，一个为NS5B N端的63～99 aa和另一个为C端的611～642 aa[41]。最近，Li等[42]通过对CSFV NS5B的晶体结构的研究，发现CSFV NS5B的N末端结构域(NTD)对于RdRp活性非常重要；Zhou等[43]研究发现猪poMx1与CSFV NS5B相互作用，抑制CSFV复制。这可能对开发抗CSFV药物提供一定的思路。

9 展望

CSFV对我国乃至世界养猪业都造成了巨大的损失，研究人员近些年对于CSFV的研究已取得了显著进展，但对在CSFV复制中发挥重要作用的如p7、NS2、NS3等非结构蛋白的研究还不透彻，非结构蛋白之间相互作用的调控机制、病毒复制的调控机制及致病机理等方面都需要不断进行探索。对CSFV非结构蛋白的了解，有助于深入理解病毒的复制过程及病毒持续感染的分子机制。本文对在CSFV复制过程中起关键作用的非结构蛋白近年来的研究进展进行了汇总，以期为今后继续研究CSFV非结构蛋白的科研人员提供参考，并对CSFV的鉴定、诊断及预防研究提供参考。