大黄酸分散体对糖尿病大鼠肝损伤的抑制机制

吕怀恩，王文永，王 蕊，王 鹏，付静波，张宝生，董晓宇，高玲焕

(1.唐山市丰润区人民医院药剂科，唐山 063000；2.华北理工大学基础医学院,唐山 063000)

糖尿病发生率有持续增长趋势，2型糖尿病发病率较高，糖尿病死亡的主要原因是后期多器官损伤，其中糖尿病肝、肾损伤占比较高[1-4]。大黄酸(rhein)是大黄等中药的活性成分，近年来研究报道较多[5]，但rhein溶出度差，吸收慢。课题组前期研究表明，以聚乙烯吡咯烷酮为载体将rhein制成固体分散体，能明显增加rhein的溶解度，提高其生物利用度，动物实验显示其对高糖所致肾损伤有抑制作用[6]。rhein具有抑制乙醇损伤肝脏作用[7]，对肝脏有保护作用，但rhein对糖尿病肝脏病理改变的影响及机制的相关文献很少，特别是大黄酸分散体(rhein-F)对糖尿病肝损伤的作用未见文献报道。本研究应用rhein-F干预糖尿病大鼠，观察其对肝损伤的影响并与rhein比较，为rhein-F的进一步研究奠定了实验基础。

1 仪器与材料

1.1仪器 GA-3型血糖仪及试纸(Sinocare)；Chemray 420 型全自动生化分析仪(美国Rayto)；200PRO 型多功能酶标仪(瑞士Tecan)；H-7650 型透射电子显微镜(日本日立有限公司)；光学显微镜(日本Olympus)；真彩病理图像分析系统(高腾科技有限公司)；5180R型高速低温离心机(德国Eppendorf)；F6-10-8G型超细匀浆机(FLUKO)；DYY-6C型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；G560E型涡旋混合器(美国Scientific Industries)；FA2104N型电子天平(上海第二天平仪器厂)；Unervirsal Hood Ⅲ型全自动曝光机(Bio-Rad Laboratories)。

1.2试药 链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，批号18883-66-4)；大黄酸(Bio-Bustyl，湖北云镁科技有限公司，批号478-43-3，质量分数>98%)；血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒(南京建成药业有限公司，批号分别为：C010-3-1、C009-3-1)；PVDF 膜(美国Milipore公司，批号K5EA5857D)；RIPA裂解液(Solarbio，批号R0020)；蛋白浓度测定试剂盒(APPLYGEN基因技术有限公司，批号P1511)；三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核因子-κB (NF-κB) 和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ抗体)，均购自Santa Cruz Biotechnology.Inc；糖基化终产物(AGEs)酶联免疫吸附(Elisa)试剂盒(武汉基因美科技有限公司)；麦芽糖(上海信裕生物科技有限公司，批号20150127);羧甲基纤维素钠(CMC-Na，淄博海澜化工有限公司,批号20161003); 3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐 (DAB，江苏凯基生物技术股份有限公司，批号20180531)；磷酸盐缓冲液(PBS，北京梦怡美生物科技有限公司，批号20160920)；戊二醛(上海复申生物科技有限公司，批号20181104)；洗膜缓冲液(TBST，自制)。

1.3实验动物 Wistar大鼠50只，SPF级，雄性，体质量为(190±25) g，大鼠普通饲料及高脂饲料，均购于北京华阜康生物科技有限公司,许可证号：SCXK(京)2014-0004。实验均在华北理工大学SPF实验室进行。

2 实验方法

2.1rhein-F的制备方法 按照参考文献方法制备[6]。

2.2大鼠2型糖尿病模型的建立 大鼠适应性饲养1周后，随机选取10只常规饲养，作为正常对照(NC)组。另外40只大鼠给予高脂饲料喂养10周，禁食20 h，尾静脉注射12.5 g·L-1STZ(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释)，注射量为25 mg·kg-1。NC组大鼠同时尾静脉注射等量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。STZ注射1周后，所有大鼠禁食8 h，取尾静脉血测定空腹血糖(FBG)，2次FBG均≥16.7 mmol·L-1的大鼠被视为造模成功，选入实验组。

2.3分组与给药 10只正常大鼠作为NC组。大鼠共成模36只，剔除血糖过高和体质量过高或较低的6只，剩余30只，按照血糖高低顺序编号，从第1只大鼠开始，按编号顺序每3只大鼠放1个笼内(共10个笼)，之后再将每个笼内的3只大鼠随机分到糖尿病模型组(DM)、rhein组和rhein-F组中，每组10只。rhein组与rhein-F组给药量均为80 mg·kg-1(所含rhein剂量相等)，rhein组与rhein-F分别用5 g·L-1的CMC-Na配成混悬液，同时NC组与DM组给予同体积CMC-Na溶液。各组大鼠每日固定同一时间给药，连续给药8周。

2.4观察指标

2.4.1FBG与餐后血糖(PBG) 给药8周后，测定大鼠禁食8 h后的FBG；给药8周后各组大鼠禁食16 h后给药，于0.5 h灌胃麦芽糖2 g·kg-1，分别检测麦芽糖灌胃后1、2 h的PBG。

2.4.2血清AST、ALT、AGEs和肝脏指数(LI)的测定 给药后禁食16 h，用100 g·L-1水合氯醛腹腔注射(3 mL·kg-1)麻醉大鼠，负压管经腹主动脉取血，分离血清。用全自动生化分析仪测定血清中AST和ALT活性，用Elisa法测定AGEs含量；取血后立即剖腹取肝脏，置于磷酸盐缓冲液(PBS)中，用吸水纸吸干血，称定肝质量。计算LI，LI=大鼠肝质量(g)÷大鼠体质量(g)×100%。

2.4.3肝组织病理学观察 切取每只大鼠1/4的肝左叶，立即置于甲醛固定液中，48 h后常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察肝组织的病理改变；马松染色(Masson)观察肝脏纤维组织的增生情况。迅速切取约0.5～1.0 mm3肝组织，置于2.5 g·L-1戊二醛中，切片超薄制备，染色，透射电镜观察超微结构及拍照。

2.4.4免疫组织化学法测定肝组织PPAR-γ和NF-κB蛋白表达 肝组织石蜡切片3.5 μm，脱蜡水化，修复抗原，血清封闭，分别加入PPAR-γ和NF-κB抗体(1∶250)，4 ℃孵育过夜，PBS洗后二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗后滴加DAB显色1 min，纯水中终止后染核。棕黄染色为阳性表达，用Image-Pro Plus 6.0测定积分光密度值(IOD值)。

2.4.5Western Blot检测肝组织PPAR-γ和NF-κB蛋白表达 液氮研磨肝组织，低温离心后取上清液，BCA蛋白定量，上样量50 μg，80 V恒压电泳，200 mA恒流电转至PVDF膜，5 g·L-1牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h，一抗(PPAR-γ1∶500，NF-κB 1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次后二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，洗膜后显影。条带采用Image J软件测定灰度值，与内参GAPDH的比值表示其相对含量。

3 结果

3.1rhein-F对糖尿病大鼠FBG和PBG的影响 见表1。由表1可知，DM组的FBG和PBG明显高于NC组(P<0.01)；rhein组和rhein-F组的FBG和PBG均明显低于DM组(P<0.01)，空腹8 h后rhein-F组血糖略低于rhein组，但差异无统计学意义(P>0.05)。灌胃麦芽糖后rhein-F组血糖值明显低于rhein组，特别是餐后1 h血糖明显低于rhein组(P<0.01)。

表1 rhein-F对糖尿病大鼠FBG和PBG的影响Tab.1 Effect of rhein-F on FBG and PBG indiabetic rats

3.2rhein-F对糖尿病大鼠血清AST、ALT、AGEs和LI的影响 见表2。DM组大鼠血清ALT、AST、AGEs和LI明显高于NC组(P<0.05 或P<0.01)，rhein组和rhein-F组的上述各指标均不同程度的低于DM组，rhein-F组降低更明显，rhein-F组对AST和AGEs的降低明显优于rhein组。

表2 rhein-F对糖尿病大鼠血清AST、ALT、AGEs和LI的影响 Tab.2 Effect of rhein-F on serum AST，ALT，AGEs and LI in diabetic rats

3.3rhein-F对糖尿病大鼠肝组织病理结构的影响 HE染色：NC组(见图1-A1)大鼠肝组织未见炎细胞浸润和小脂滴，组织结构基本正常；DM组(见图1-A2)大鼠肝组织结构紊乱，肝细胞出现脂肪变性，散在炎症细胞浸润和片状出血点；rhein组(见图1-A3)和rhein-F组(见图1-A4)脂滴空泡和炎症细胞明显减少，肝组织形态结构明显改善，rhein-F组肝组织形态结构明显优于rhein组。

Masson染色：NC组大鼠肝组织在门静脉处几乎未见亮绿染色的胶原纤维物质(见图1-B1)；DM组肝脏组织可见较多的亮绿染色的胶原纤维，主要分布在血管和汇管区周围(见图1-B2)；与DM组比较，rhein组(见图1-B3)和rhein-F组(见图1-B4)亮绿染色组织减少。

透射电镜：NC组大鼠肝细胞核膜光滑，核较大，包浆中内质网、高尔基体等细胞器丰富，形态正常(见图1-C1)；DM组肝细胞内可见线粒体肿胀，空泡化，数量减少，内质网扩张和断裂，可见散在脂滴和胶原纤维(见图1-C2)；rhein组(见图1-C3)和rhein-F组(见图1-C4)肝细胞超微结构明显改善，少见脂滴和胶原纤维，rhein-F组超微结构改变较rhein组轻。

图1 糖尿病大鼠肝脏组织的形态结构1.正常对照组；2.糖尿病模型组；3.大黄酸组；4.大黄酸分散体组；A.苏木精-伊红染色结果；B.马松染色结果；C.透射电镜结果。Fig.1 Morphological structure of liver tissues in diabetic rats1．NC group；2.DM group；3.rhein group；4.rhein-F group；A.HE staining；B.Masson staining；C.Electronic microscope.

3.4rhein-F对糖尿病大鼠肝组织PPAR-γ和NF-κB蛋白表达的影响 见图2和表3。

图2 糖尿病大鼠肝组织中PPAR-γ和NF-κB蛋白表达的免疫组化图片和Western Blot条带Fig.2 Immunohistochemistry images and Western Blot bands of PPAR-γ and NF-κB protein expression in liver tissues of diabetic rats

表3 糖尿病大鼠肝组织中PPAR-γ和NF-κB蛋白表达的免疫组化和Western Blot结果Tab.3 Immunohistochemistry and Western Blot results of PPAR-γ and NF-κB protein in liver tissues of diabetic rats

3.4.1免疫组化结果 由图2和表3可知，NC组大鼠肝组织PPAR-γ蛋白质表达呈强阳性，可见较多棕黄色染色颗粒，以细胞浆分布为主；NF-κB蛋白在NC组肝组织中几乎无表达；而DM组PPAR-γ和NF-κB蛋白表达量与NC组相反(P<0.01)；rhein组PPAR-γ蛋白质表达明显高于DM组(P<0.05)，NF-κB蛋白表达明显低于DM组(P<0.01)；rhein-F组作用强于rhein组。

3.4.2Western Blot结果 由图2和表3可知，大鼠肝组织PPAR-γ蛋白表达条带的灰度值NC组和rhein-F组明显高于DM组(P<0.01)，而NF-κB蛋白的表达DM组明显高于NC组和rhein-F组(P<0.01)；rhein-F组上调PPAR-γ蛋白表达和下调NF-κB蛋白表达的作用强于rhein组。Western Blot结果与免疫组化结果基本一致。

4 讨论

多数复方中药中均含有rhein，如三黄泻心汤、大黄附子汤及茵陈蒿汤等[8]，其中发挥药效的主要活性成分为rhein[9]。但由于rhein是难溶性的，使其很难充分发挥作用。因此，近年来利用药物制剂新技术对rhein的新剂型和结构改造进行了大量研究，明显地提高了其生物利用度[10-11]。固体分散体技术可增加难溶性药物的溶解度和溶出速率，提高药物的生物利用度，从而充分发挥药物活性[12-14]。本实验在前期研究的基础上，观察了rhein-F对2型糖尿病大鼠肝损伤的抑制作用，测定相关蛋白表达含量探讨其作用机制，并与单纯rhein比较。血糖测定结果显示，rhein组和rhein-F组均可降低FBG，但二者之间差异无统计学意义(P>0.05)；rhein-F组对PBG的降低更明显，特别是对餐后1 h血糖的降低明显强于rhein组，表明rhein-F作用更快、更强，可能与rhein-F使rhein溶出度增加、提高生物利用度有关，因此，rhein-F能更好地抑制PBG的升高。

rhein-F组对AST和AGEs的降低作用明显强于rhein组，表明rhein-F改善糖尿病肝功能的作用强于rhein；同样rhein-F对高糖所致肝脏病理损伤的抑制作用也强于rhein，主要表现在抑制肝组织脂肪变性、抑制胶原纤维增生和超微结构的改变，显示了rhein-F有更好的肝保护作用。

进一步探讨rhein的作用机制发现，rhein和rhein-F都可使肝组织中PPAR-γ蛋白表达水平升高、NF-κB蛋白表达水平降低；免疫组化和Western Blot方法结果基本一致，且rhein-F作用强于rhein。研究发现，NF-κB是炎症反应的中心介质，而PPAR-γ可抑制NF-κB的活性和增加胰岛素敏感性[15]。Yu C等[16]报道，rhein可通过抑制NF-κB活性达到预防内毒素所致急性肾损伤。曾庆云等[14]研究发现，rhein可促进PPAR-γ蛋白表达，改善胰岛素敏感度。同时rhein具有较强的抗炎、抗氧化和抗细胞外基质增生作用[17-19]。本研究表明，rhein及rhein-F抑制糖尿病肝损伤的机制可能与其上调PPAR-γ和下调 NF-κB蛋白表达及降糖、抑制AGEs产生有关。推测rhein为过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的激动剂，达到降糖作用和抗炎作用,从而发挥肝保护作用。

前期研究已报道rhein-F的溶解度增大，生物利用度增加，稳定性更高[6]。STZ糖尿病模型大鼠和自发2型糖尿病db/db小鼠都灌胃给予rhein和rhein-F (二者所含rhein剂量同等)，结果显示，二者均可减轻肾组织病理损伤，改善糖尿病肾功能[20-21]。但rhein对糖尿病肝损伤的影响研究报道较少，本实验应用高脂饮食与STZ制备2型糖尿病大鼠模型，进一步考察了rhein-F对糖尿病肝功能及肝组织病理损伤的影响，结果显示，rhein和rhein-F具有良好的保护组织器官的作用，与rhein相比，rhein-F具有作用更快、更强和更持久的特点，再次证明了rhein-F作用优于rhein。

综上所述，rhein-F可降低血糖，抑制肝脏组织病理损伤，对糖尿病肝脏有保护作用，同等剂量下作用优于rhein。作用机制除了抗炎、抗氧化外，尚与抑制AGEs产生及上调PPAR-γ和下调 NF-κB蛋白表达有关。