芒果苷、山柰酚和栀子苷对高尿酸血症小鼠的作用

张 妍，李 瑶，赵亚妮，许 璐，袁佳妮，安军明，王四旺*

(1.陕西中医药大学针灸推拿学院，咸阳 712046；2.西北大学生命科学与医学部，西安 710069；3.空军军医大学药学系中药与天然药物学教研室，西安 710032；4.西安市中医医院针灸科，西安 710021)

高尿酸血症是机体内嘌呤代谢紊乱引发的一种代谢性疾病，以尿酸(UA)升高为主要特征。UA水平升高主要有生成过多和(或)排泄不足2种途径[1-2]。芒果苷又名芒果素、知母宁，是芒果叶中的主要活性成分，可从百合科植物知母中提取[3-4]。栀子苷是从栀子中提取得到的主要有效成分，具有促进胆汁和胰腺分泌、改善肝脏和胃肠功能、增强机体抗病能力等功效[5-6]。山柰酚属于黄酮类化合物，主要来源于姜科植物山柰的根和茎，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等药理作用[7-8]。芒果苷、山柰酚和栀子苷均可降低高尿酸血症动物模型UA水平[9-12]。本研究采用酵母联合腺嘌呤饲料喂养的造模方法，旨在对比观察不同剂量的芒果苷、山柰酚和栀子苷对高尿酸血症小鼠的降UA作用和对血清黄嘌呤氧化酶(XOD)的影响，同时测定给药2周后小鼠血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平以及胸腺、脾脏和肾脏指数，以评判对小鼠肾功能及免疫器官的影响，HE染色观察对肾脏组织的病理变化。

1 仪器与材料

1.1仪器 RT-9600型半自动生化分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；电子分析天平(德国赛多利斯天平公司)；Biofuge Primo R型多用途台式高速离心机(德国Heraeus公司)；SpectraMax 190型酶标仪(美国Molecular Devices公司)；XK96-A型快速混匀器(姜堰市新康医疗器械有限公司)。

1.2试药 芒果苷(质量分数>98.08%，批号SH181018-2)，陕西桑禾生物科技有限公司；山柰酚(质量分数>98.23%，批号HK20180610)，陕西慧科植物开发有限公司；栀子苷(质量分数>99.5%，批号DNYF1904065)，西安岳达生物科技有限公司；酵母粉，英国OXOID公司；腺嘌呤，北京索莱宝科技有限公司；UA、BUN测定试剂盒，上海荣盛生物药业有限公司；Cr、XOD测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.3动物 SPF级雄性昆明种小鼠120只，体质量为28～32 g，购自空军军医大学实验动物研究中心(动物许可证号：SCXK(军)2012-0007)；正常摄食饮水，保持在25 ℃，相对湿度40%，12 h光照黑暗周期循环，适用性饲养1周后用于实验；所需饲料和舒克贝塔SPF级精选刨花垫料，均购于江苏省协同医药生物工程有限责任公司。

2 方法

2.1高嘌呤饲料的制备 将酵母粉和腺嘌呤拌入粉碎的颗粒饲料中，混匀，重压成型。酵母粉在饲料中的含量为10%，腺嘌呤在饲料中的含量为0.1%[13-15]。

2.2高尿酸血症模型的建立、分组及给药 将120只雄性昆明种小鼠适用性饲养1周后，随机分组：空白组，模型组，别嘌醇组(20 mg·kg-1)，芒果苷低、中、高剂量组(7.5、15、30 mg·kg-1)，山柰酚低、中、高剂量组(7.5、15、30 mg·kg-1)，栀子苷低、中、高剂量组(7.5、15、30 mg· kg-1)，每组各10只。模型组及各给药组给予高嘌呤饲料，空白组给予普通饲料，各组均灌胃给药，空白组与模型组均给予等体积生理盐水，每日给药1次，连续给药14 d，记录小鼠的摄食饮水情况及实验前后的体质量。

2.3小鼠血清相关指标的测定 末次给药后，小鼠禁食不禁水24 h，各组小鼠摘眼球取血，室温静置2 h，在4 ℃条件下以3 500 r·min-1离心15 min，吸取上层血清。按照试剂盒说明书分别检测小鼠血清中UA、BUN、Cr含量及XOD活性。

2.4小鼠胸腺、肾脏和脾脏指数的测定 取血后采用断颈法处死小鼠，快速分离小鼠胸腺、脾脏及双侧肾脏，称定质量，计算脏器指数。胸腺指数=胸腺质量÷小鼠禁食后体质量×100%；脾脏指数=脾脏质量÷小鼠禁食后体质量×100%；肾脏指数=肾脏质量÷小鼠禁食后体质量×100%[16-17]。

2.5肾脏组织的病理学观察 称定肾脏质量后，用100 g·L-1甲醛固定肾脏组织，常规石蜡包埋并制片，HE染色，光镜下观察肾脏组织的病理学变化。

3 结果

3.1不同剂量芒果苷、山柰酚和栀子苷对高尿酸血症小鼠一般情况的影响 实验期间，与空白组比较，模型组及别嘌醇组小鼠出现食欲不振、饮水增多、体质量增长缓慢、精神萎靡等症状，芒果苷、山柰酚和栀子苷各剂量组小鼠摄食饮水及体质量增长情况良好。

3.2不同剂量芒果苷、山柰酚和栀子苷对高尿酸血症小鼠血清中UA、Cr和BUN含量的影响 见表1。由表1可知，与空白组相比，模型组小鼠血清中UA和Cr含量显著升高(P<0.01)，BUN含量有升高趋势但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，芒果苷、山柰酚和栀子苷各剂量组及别嘌醇组血清UA含量均明显下降(P<0.05)，别嘌醇组血清Cr和BUN含量显著升高(P<0.01)。

表1 芒果苷、山柰酚和栀子苷对高尿酸血症小鼠血清中UA、Cr和BUN含量的影响Tab.1 Effects of different doses of mangiferin，kaempferol and gardenin on blood UA，Cr and BUN in hyperuricemia mice

3.3芒果苷、山柰酚和栀子苷各剂量组对高尿酸血症小鼠血清中XOD活性的影响 见表2。由表2可知，与空白组比较，模型组小鼠血清中XOD活性显著升高(P<0.01)；与模型组比较，芒果苷高剂量组，山柰酚低、中、高剂量组，栀子苷中、高剂量组以及别嘌醇组血清XOD活性明显降低(P<0.05)。

表2 芒果苷、山柰酚和栀子苷各剂量组对高尿酸血症小鼠血清中XOD活性的影响Tab.2 Effects of different doses of mangiferin,kaempferol and gardenin on xanthine oxidase activity in hyperuricemia mice

3.4芒果苷、山柰酚和栀子苷对高尿酸血症小鼠胸腺、脾脏和肾脏指数的影响 见表3。由表3可知，与空白组相比，模型组小鼠胸腺、脾脏和肾脏指数差异均无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，别嘌醇组脾脏、肾脏指数明显增大(P<0.01或P<0.05)。

表3 芒果苷、山柰酚和栀子苷各剂量组对高尿酸血症小鼠胸腺、脾脏和肾脏指数的影响Tab.3 Effects of different doses of mangiferin，kaempferol and gardenin on thymus，spleen and renal index in hyperuricemia mice

3.5芒果苷、山柰酚和栀子苷对小鼠肾脏组织病理学的影响 见图1。由图1可知，与空白组相比，模型组肾小管扩张，上皮细胞空泡变性，部分细胞红染，管腔内可见少量黄褐色尿酸盐结晶。别嘌醇组肾小球囊壁层收缩，结构不完整，肾小管扩张明显。芒果苷、山柰酚和栀子苷各剂量组较模型组均有所改善，肾小管内无尿酸盐结晶。

图1 小鼠肾脏组织的病理学变化(×200)A.空白组；B.模型组；C.别嘌醇组；D.芒果苷低剂量组；E.芒果苷中剂量组；F.芒果苷高剂量组；G.山柰酚低剂量组；H.山柰酚中剂量组；I.山柰酚高剂量组；J.栀子苷低剂量组；K.栀子苷中剂量组；L.栀子苷高剂量组。Fig.1 Histopathological changes of kidney tissue (×200)A.blank group；B.model group；C.allopurinol group；D.mangiferin low dose group；E.mangiferin middle dose group；F.mangiferin high dose group；G.kaempferol low dose group；H.kaempferol middle dose group；I.kaempferol high dose group；J.gardenin low dose group；K.gardenin middle dose group；L.gardenin high dose group.

4 讨论

高尿酸血症是痛风的生化基础，也是代谢紊乱综合征、心血管疾病和慢性肾脏疾病等独立危险因素[18-19]。过量的UA在体内长期蓄积，会导致尿酸盐结晶析出，沉积在肾及关节等部位，引起痛风及肾脏疾病，因此维持UA在正常水平对预防痛风及其他疾病具有重要的临床意义。

研究结果显示，模型组UA含量及XOD活性较空白组显著增加，提示造模成功。本实验造模方法在相关文献[20，13-15]及预实验的基础上，结合临床高尿酸血症病人因长期摄入高嘌呤饮食而形成UA持续升高的状态，将酵母和腺嘌呤按照一定比例混入饲料中喂养小鼠。腺嘌呤属于高嘌呤物质，而酵母富含蛋白质、核苷酸、B族维生素和酶等多种物质，可在机体内水解合成包含嘌呤碱类、嘧啶碱类等含氮有机碱、磷酸等尿酸的前体物质，当机体摄入大量的酵母膏及腺嘌呤时，便会干扰机体正常的嘌呤代谢，致使XOD活性增强，机体生成过多的UA[21]。芒果苷、山柰酚和栀子苷各剂量组及别嘌醇组均能显著降低UA水平，其中山柰酚的降UA作用最佳。XOD是参与体内嘌呤类化合物代谢的关键酶，广泛存在于人体中，主要分布于肝脏中，随着机体高嘌呤饮食摄入的增多，其活性逐渐升高，从而使肝细胞膜的通透性增加，导致细胞中XOD进入血液循环，活性升高[22-23]。次黄嘌呤在XOD的催化下生成黄嘌呤，黄嘌呤进一步经XOD的氧化而转化生成UA，因此，抑制XOD活性是治疗高尿酸血症的重要靶点。芒果苷高剂量组和山柰酚低、中、高剂量组及栀子苷中、高剂量组以及别嘌醇组血清XOD活性显著下降，表明芒果苷、山柰酚和栀子苷可通过抑制血清XOD活性来降低UA水平，山柰酚对血清XOD活性的抑制最明显，这可能与山柰酚竞争性抑制XOD活性有关[24]。

血清Cr和BUN是评判肾功能的重要指标，模型组小鼠血清Cr显著升高，提示该模型对肾脏有一定的损伤，可能是由于尿酸盐沉积于肾脏引发的，芒果苷、山柰酚和栀子苷各剂量组较模型组血清Cr均有所下降，表明芒果苷、山柰酚和栀子苷对肾脏有一定的保护作用。但别嘌醇组小鼠血清Cr和BUN明显升高，且远超于模型组，表明别嘌醇具有一定的肾毒性。

脏器指数结果表明，模型组小鼠胸腺、脾脏和肾脏指数与空白组比较差异均无统计学意义，但脾脏与肾脏指数有增大趋势，别嘌醇组脾脏、肾脏指数明显增大，提示脾脏、肾脏出现病变，而芒果苷、山柰酚和栀子苷各剂量组脏器指数基本正常。同时肾脏病理结果显示，模型组小鼠肾小管扩张，细胞红染，可见少量黄褐色尿酸盐沉积，芒果苷、山柰酚和栀子苷各剂量组较模型组均有所改善，但别嘌醇组肾小球囊壁层收缩，结构不完整，肾小管扩张明显，表明别嘌醇组肾脏损害严重。

综上所述，芒果苷、山柰酚和栀子苷均可通过抑制XOD活性对酵母联合腺嘌呤饲料喂养的高尿酸血症模型小鼠具有降UA作用，毒性和不良反应小，对肾脏有一定的保护作用，其中山柰酚降UA效果最佳，可作为具有潜力的天然降UA药物进一步研究。