伸筋草总生物碱改善大鼠类风湿性关节炎的机制研究

张妍妍，冯宇飞，肖洪彬

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病，可发生于任何年龄段，影响患者的关节和运动系统，且常累及肾脏、心脏和呼吸系统，具有较高的致残率[1]。流行病学研究表明，我国RA的发病率为0.42%[2]，该病不仅降低了患者的生活质量，而且给患者家庭和社会带来了极大的经济负担。

迄今为止，RA的确切病因尚未完全阐明，目前的治疗主要以药物和手术为主，配以适当的理疗。中医药治疗RA经验丰富、疗效独特，且安全性高[3-4]。伸筋草别名过山龙，根部及全草皆可入药，其性温、味辛、苦，具有消肿、除风湿、祛风散寒、舒筋活络之功效，临床主治风寒湿痹导致的关节酸痛，效果令人满意[5-6]。本课题组前期研究结果表明，伸筋草总生物碱可通过降低RA大鼠脾脏淋巴细胞的增殖和炎性浸润而发挥治疗作用。本研究采用免疫印迹(Western Blot)法、酶联免疫吸附(Elisa)法探讨伸筋草总生物碱对弗氏佐剂所致RA大鼠滑膜组织白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK1)/肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF6)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响。

1 仪器与材料

1.1仪器 1658033型电泳仪，美国Bio-rad公司；Tanon 4800 Multi型凝胶电泳成像分析系统，北京原平皓生物技术有限公司；DB066型足趾容积测量仪，北京智鼠多宝生物科技有限责任公司；AP-HX型恒温箱，东莞市爱佩试验设备有限公司；EPOCH型酶标仪，BioTek公司；TGL16M型低温离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.2试药 伸筋草药材(批号170110)，哈药集团世一堂中药饮片有限责任公司；伸筋草总生物碱提取物，实验室自制；乙酸(国药集团化学试剂有限公司)；水合氯醛(天津市科密欧化学试剂有限公司)；甲氨蝶呤(HPLC级，批号100138-201804)，上海铭博生物科技有限公司；牛Ⅱ型胶原(批号150342)，Chondrex公司；弗氏佐剂(批号1002036152)，Sigma公司；大鼠γ干扰素(IFN-γ，批号K1052-100)和白细胞介素-1β(IL-1β，批号K4796-100)Elisa 试剂盒，均购自Biovision公司；兔抗大鼠IRAK1、TRAF6和NF-κB p65一抗，Abcam公司；Trizol(批号135306)，Ambion公司。

1.3动物 清洁级雄性Wistar大鼠，6～7月龄，体质量为(230±25) g，由黑龙江中医药大学GLP实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(吉)-2018-0007。实验环境控制在每12 h明暗自动切换，自动换气，温度为(25±2) ℃，相对湿度在45%～75%范围内。

2 方法

2.1伸筋草总生物碱溶液的制备 取伸筋草药材粗粉，加2 ml·L-1的盐酸渗漉提取，将渗漉液分别调节pH值至4、7进行梯度沉淀，过滤后，滤液上001×7阳离子交换树脂柱，先用水洗至中性，再用50 mL·L-1的氨水洗脱，洗脱液减压回收、烘干，即得伸筋草总生物碱提取物。取上述伸筋草总生物碱提取物，加适量生理盐水配制成质量浓度为0.2 mg·mL-1的伸筋草总生物碱溶液。

2.2大鼠RA模型的制备 将牛Ⅱ型胶原用0.1 mol·L-1的乙酸溶解，配制成质量浓度为2 mg·mL-1的牛Ⅱ型胶原乙酸溶液，按照1∶1的比例加入弗氏佐剂配制成弗氏完全佐剂的乳剂，备用。用100 g·L-1的水合氯醛以3 mL·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定。3个定点部位(右后足趾、尾部、背部)注射弗氏完全佐剂的乳剂，注射剂量为0.05 mL·部位-1·次-1[7]。首次皮下注射10 d后，重复注射1次，剂量和注射部位与第1次相同，以激发大鼠免疫反应[8]。第2次注射弗氏佐剂后于第3 天观察实验动物耳缘、后趾和尾部肿胀情况，以出现显著的炎性结节、表皮红肿为大鼠RA造模成功，未造模成功的大鼠被剔除。

2.3分组及给药 模型复制前，采用足趾容积测量仪测定每只大鼠右后踝关节体积作为基线V0。将造模成功的40只Wistar大鼠随机分为模型组、阳性对照组和伸筋草高、低剂量组，每组10只，另加入10只大鼠按照2.2项下造模方法每次注射等体积生理盐水，作为正常组。分组后次日各组大鼠开始灌胃给药，给药前采用足趾容积测量仪测定每只大鼠右后踝关节体积V1。阳性对照组每日给予甲氨蝶呤溶液0.5 mg·kg-1(以甲氨蝶呤计)，伸筋草高、低剂量组每日给予伸筋草总生物碱溶液8、4 mg·kg-1(以伸筋草总生物碱提取物计)，正常组和模型组大鼠每日同一时间给予等体积的生理盐水，连续给药3周。

2.4取材及检测 各组大鼠末次给药后次日给予100 g·L-1水合氯醛麻醉(3 mL·kg-1)，用足趾容积测量仪测定各组大鼠右后踝关节体积V2，计算出大鼠踝关节肿胀程度D=(V2-V0)÷V0×100%。毛细管眼底眶静脉丛穿刺取血1 mL后，脱颈处死，取右后踝关节，钝性剥离踝关节滑膜组织，低温保存。静脉血静置15 min，在低温离心机中以3 000 r·min-1离心10 min后，取上层血清，用Elisa法测定IL-1β和IFN-γ水平。取出低温保存的大鼠滑膜组织，粉碎后在液氮中研磨，加入细胞裂解液低温静置30 min，在低温离心机中以10 000 r·min-1离心10 min，收集上清液，进行SDS-PAGE电泳，蛋白上样量为50 μg，电转到PVDF膜，用TBST漂洗后加入50 g·L-1的脱脂奶粉，密封避光孵育2 h，反复漂洗3次，分别加入一抗(IRAK1、TRAF6、NF-κB p65的1∶500稀释液)4 ℃恒温温育过夜。于次日反复漂洗3次后，加入二抗稀释液，TBST漂洗3次后，将PVDF膜置于ECL显色液中曝光，采用凝胶电泳成像自动分析系统对灰度值进行定量分析。

3 实验结果

3.1伸筋草总生物碱对RA大鼠踝关节肿胀程度变化的影响 结果见表1。由表1可知，与正常组比较，模型组、阳性对照组和伸筋草高、低剂量组给药前大鼠踝关节肿胀极为明显(P<0.05)。与模型组比较，伸筋草高、低剂量组和阳性对照组给药3周后大鼠踝关节肿胀程度均有不同程度的缓解(P<0.05)。

表1 伸筋草总生物碱对RA大鼠踝关节肿胀程度变化的影响Tab.1 Effect of Lycopodium clavatum alkaloids on the degree of ankle swelling in RA rats

3.2伸筋草总生物碱对RA大鼠IRAK1、TRAF6、NF-κB p65蛋白表达的影响 结果见图1和表2。由图1和表2可知，与正常组比较，模型组IRAK1、TRAF6和NF-κB p65的蛋白表达均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，伸筋草高、低剂量组IRAK1、TRAF6和NF-κB p65蛋白表达显著降低(P<0.05)，且呈一定的量效关系。

图1 Western Blot电泳图Fig.1 Western Blot electrophoretogram

表2 伸筋草总生物碱对RA大鼠IRAK1、TRAF6和NF-κB p65蛋白表达的影响Tab.2 Effect of Lycopodium clavatum alkaloids on the protein expression of IRAK1，TRAF6 and NF-κB p65 proteins in RA rats

3.3伸筋草总生物碱对RA大鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平的影响 结果见表3。由表3可知，与正常组相比，模型组大鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，伸筋草高剂量组大鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平显著下降(P<0.05)，伸筋草低剂量组IL-1β水平显著降低(P<0.05)，IFN-γ水平虽有下降的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 伸筋草总生物碱对RA大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平的影响Tab.3 Effect of Lycopodium clavatum alkaloids on serum levels of IL-1β and IFN-γ in RA rats

4 讨论

皮下注射弗氏佐剂是经典的RA大鼠造模方法，该方法成模率高，模型复制稳定，持续时间长，且与人类RA的发病特点相似，广泛用于基础实验研究[9]。本研究首先通过容积排水法验证了伸筋草总生物碱具有明确的降低弗氏佐剂诱导的RA大鼠踝关节肿胀的作用，实验结果为后续的机制研究奠定了药效学基础。

NF-κB的活化会激活免疫反应，促进下游如IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性因子的释放[10-11]。NF-κB p65是最早发现的NF-κB家族成员之一，其蛋白表达与RA滑膜组织的病变密切相关。IRAK1是NF-κB信号通路中的接头分子，可介导细胞内炎性发生的信号通路[12]。研究表明，通过抑制IRAK1可明显降低白细胞介素-6 (IL-6)、IL-1β等炎性因子的释放，进而防止过度的炎性反应[13-14]。TRAF6是一种连接酶，活化后会形成具有特异性受体功能的短链蛋白，可同时与IRAK1、NF-κB分子相结合[15]，将三者连接起来，启动细胞内炎性反应的信号[16]。因此，TRAF6的表达可间接反映NF-κB信号通路的活跃程度[17]。本研究结果表明，伸筋草总生物碱可通过抑制IRAK1、TRAF6、NF-κB p65的蛋白表达来降低IRAK1/TRAF6/NF-κB信号通路的活跃程度。

IL-1β是NF-κB信号通路中下游重要的炎性因子，与RA的发病密切相关[18]，同时，IL-1β又可反向激活NF-κB，通过正反馈作用促进更多的炎性因子产生[19]，进而造成恶性循环。IFN-γ是由辅助性T1细胞(Th1)分泌的细胞因子，不仅可以激活巨噬细胞和自然杀伤细胞并提高抗原递呈能力，还能抑制辅助性T2细胞(Th2)分泌抗炎因子来加强RA的自身免疫炎性反应[20]。Elisa实验结果表明，伸筋草总生物碱可有效降低血清中IL-1β和IFN-γ水平。

综上所述，伸筋草总生物碱可降低RA大鼠踝关节的肿胀，其作用机制与抑制IRAK1/TRAF6/NF-κB信号通路及其下游炎性因子的分泌密切相关。