一枝蒿提取物对GERD大鼠肺顺应性及食管炎症因子的影响

李治建，韩梦婷，罗福祥，霍仕霞，窦 勤，买买提·艾力，斯拉甫·艾白

(新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，乌鲁木齐 830049)

胃食管反流病(GERD)系指胃内容物反流入食管，引起不适症状和(或)并发症的一种疾病。GERD气道高反应如咳嗽、哮喘和支气管炎等，严重影响患者的生活质量，胃食管反流病咳嗽(GERC)是GERD的唯一表现[1-2]。GERC采用常规抑酸治疗效果并不理想，质子泵抑制剂(PPIs)的过度使用会造成一系列安全问题[3-4]，因此寻找有效的治疗药物非常必要。一枝蒿(ArtemisiarupestrisL.)是新疆中医民族医常用药，具有清热解毒、消食健胃、利胆和解蛇毒等功能[5]，具有抗炎、抗变态反应、抗氧化、抗病毒、保肝降酶、调节免疫及健胃促消化等多种作用[6-7]，对急、慢性炎症及炎性渗出均有明显的抑制作用，对速发型变态反应有明显的抑制作用[8]；一枝蒿还具有调节胃肠蠕动的药理作用[9]，当地民族医常用其防治各种胃肠道及呼吸道疾病[10]。本研究利用GERD大鼠模型，观察一枝蒿提取物对GERD所致气道高反应的改善作用及食管炎症因子表达的影响，为其开发利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1仪器 FM肺功能检测系统，上海玉研科学仪器有限公司；Nefuqe 15R型高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司；GL-88B型漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；K5500型核酸蛋白定量仪，北京凯奥科技发展有限公司；DYY-6C型电泳仪、DYCZ-21型电泳槽，均购自北京市六一仪器厂；2500型凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；Bio-Rad MyCycler Thermal Cycler PCR仪，美国伯乐公司；ABI 7500 Real Time PCR 设备，美国ABI公司。

1.2试药 一枝蒿提取物：一枝蒿药材(ArtemisiaRupestrisL.)产自新疆阜康，新疆本草堂大药房提供(批号20160729)，由新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所药剂室提取。注射用头孢呋辛钠(批号K171211)，国药集团化学试剂有限公司；胃蛋白酶(CAS号：9001-75-6)和瞬时感受器电位香草酸受体1(TRPV1)拮抗剂(CAS号：138977-28-3)，均购自美国Sigma公司；葡萄糖粉针剂(批号180426)，重庆和平制药有限公司；5-HT4拮抗剂(CAS号：144625-51-4，批号GR113808)，Abcam公司；琼脂糖(批号A811BA0014)，生工生物工程(上海)股份有限公司；乙酰甲胆碱(Mch,批号9072217)，北京伟康世纪医疗科技有限公司；Trans2K DNA Marker(批号BM101)，TransZol Up(批号ET111)和AT311逆转录试剂盒，均购自北京全式金生物技术有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和溶血卵磷脂酰基转移酶2(LPCAT2)荧光定量试剂盒(批号208054)，均购自Qiagen凯杰公司；荧光定量引物，乌鲁木齐欧易生物医学科技有限公司。

1.3动物 雄性SD大鼠60只，体质量为180～220 g，购于新疆医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(新)2016-0003。饲养条件为新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所SPF级动物房，每笼大鼠塑料笼盒中饲养动物少于5只，自由饮水摄食。室温为20～26 ℃，相对湿度为40%～70%，光照黑暗各12 h；实验前适用性饲养5 d，经过一般行为学观察，选用健康并符合要求的大鼠进行实验。实验中全部操作均遵循新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所实验动物伦理委员会的相关规定。

2 方法

2.1GERD模型的建立及药物干预 将一枝蒿药材粉碎，采用10倍量体积分数为80%的乙醇提取3次，每次1 h，合并3次提取液浓缩成质量浓度为0.6 g·mL-1的一枝蒿提取液。将60只健康SD大鼠随机分为假手术组、模型组及一枝蒿提取物低、中和高剂量组(1、2、4 g·kg-1)和阳性对照组(TRPV1拮抗剂0.5 μmol·kg-1)。自由饮水饮食7 d后进行造模。除假手术组外，其余各组大鼠均取上腹正中切口，用外径为4 mm的玻璃棒从胃体部位穿刺入胃，通过幽门至十二指肠，避开肠部各处血管，缝扎玻璃棒外包裹的幽门及十二指肠部分，将玻璃棒穿过贲门处，在内部扩张贲门，使贲门括约肌加剧松弛，缝合胃部后于食管胃交界处纵行切开食管下括约肌，分离至黏膜暴露于视野中。假手术组腹部正中切口在胃部开孔后缝合，暴露腹腔脏器15 min后关腹，关腹前翻动腹腔相关脏器数次，各组均给予头孢呋辛钠和葡萄糖0.05 g·mL-1术后支持[11-13]。

2.2大鼠肺顺应性检测 末次给药后，次日进行肺功能激发实验。将大鼠麻醉后固定，行气管插管：切开颈部皮肤，钝性分离出气管，暴露气管后用缝合线穿过气管，在气管开倒T形进口，插入气管插管后行结扎固定。采用密闭的体积描记系统对各组大鼠的气道反应性进行测定。将大鼠密封于体描箱内，待基线稳定后，使用不同浓度的Mch溶液进行支气管激发。每次激发结束，待基线恢复稳定再进行第二次激发并检测。观察并计算不同Mch浓度激发下其气道阻力参数的变化情况。肺顺应性减少百分比=(激发前肺顺应性值-激发后肺顺应性值)÷激发前肺顺应性值×100%[14]。

2.3大鼠食管组织中TNF-α、IL-1β、IL-6及LPCAT2 mRNA表达量的分析 RNA提取：(1)组织样本用液氮充分研磨，取样本50 mg置于离心管中，加入Trizol 1 mL，混匀，室温放置10 min至组织完全裂解。(2)加入氯仿200 μL，混匀，室温放置5 min。(3)在4 ℃条件下，以12 000 r·min-1离心15 min。(4)吸取上清液，置于离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20 ℃放置30 min。(5)重复步骤(3)，倒掉上清液，加入体积分数为75%的乙醇，使沉淀漂浮，洗涤。(6)重复步骤(3)，倒掉上清液。(7)重复步骤(6)。空管离心，吸尽液体，晾干。用RNase free Water溶解沉淀。核酸蛋白定量仪检测RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。剩余RNA于-80 ℃保存或直接反转录成第一链cDNA，用于后续实验。第一链cDNA合成配置体系由Total RNA定量至800 ng，加入Random Primer (0.1 μg·μL-1) 1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、TransScript@RT/RI Enzyme Mix 1 μL和gDNA Remover 1 μL，最后加入RNase-free Water稀释至 20 μL。混匀后25 ℃反应10 min，42 ℃反应30 min，85 ℃反应5 s，取出，结束反转录实验。将反转录得到的cDNA于-80 ℃保存，用于后续实验。引物信息见表1。荧光定量PCR体系：2×SYBR Green Select Mix 5 μL、Forward Primer 0.7 μL、Reverse Primer 0.7 μL、ROX 0.05 μL、cDNA 1 μL、RNase-free Water至10 μL；荧光定量PCR程序：预变性95 ℃、2 min，1个循环；变性95 ℃、5 s，40个循环；退火/延伸60 ℃、30 s，40个循环[10]。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

3 结果

3.1一枝蒿提取物对GERD大鼠肺顺应性减少百分比的影响 见表2。由表2可知，各组随着Mch浓度的增加，肺顺应性减少百分比逐渐增加。与假手术组比较，当Mch浓度为0.5 mmol·L-1时，各组顺应性减少百分比差异无统计学意义(P>0.05)；当Mch浓度为1、2、4、8 mmol·L-1时，模型组肺顺应性减少百分比明显升高(P<0.05)。与模型组比较，一枝蒿提取物高、中、低剂量组以及阳性对照组肺顺应性减少百分比均显著降低(P<0.05或P<0.01)。

表2 一枝蒿对GERD大鼠肺顺应性减少百分比的影响Tab.2 Effect of Artemisia rupestris extract on the percentage of lung compliance reduction in GERD rats

3.2一枝蒿提取物对大鼠食管组织中各基因mRNA表达的影响 见图1和表3。由图1可知，PCR产物大小符合检测基因的片段长度，产物条带单一。由表3可知，与假手术组相比，模型组大鼠食管组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和LPCAT2表达均显著升高；与模型组相比，阳性对照组TNF-α表达显著降低(P<0.05)，一枝蒿提取物高剂量组TNF-α、IL-6和LPCAT2表达均显著降低(P<0.05)。

表3 一枝蒿提取物对GERD大鼠食管组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和LPCAT2 mRNA表达的影响Tab.3 Effect of Artemisia rupestris extract on expression of TNF-α，IL-1β，IL-6 and LPCAT2 mRNA in esophageal tissue of GERD rats

图1 PCR产物鉴定电泳图Fig.1 Electrophoresis of PCR product identification

4 讨论

神经生理学研究表明，绝大多数食管内的迷走神经感受器激活后可诱发C纤维动作电位[15]。TRPV1在迷走神经C纤维上表达，对辣椒素、酸、温度或炎症介质非常敏感，也称辣椒素敏感受体。TRPV1激活后，可开放离子通道，C纤维兴奋后末梢释放神经肽，可直接刺激咳嗽感受器引发呼吸道症状，或通过介导NK1受体表达促使神经生长因子(NGF)、TNF-α等炎症介质生成增多引起炎症，从而影响气道敏感性，间接引发呼吸道症状，造成肺顺应性降低。对GERC患者进行食管内酸灌注或辣椒素刺激，气道对刺激的敏感性明显增高[16-17]。一枝蒿提取物可明显改善GERD大鼠肺顺应性降低的症状与改善搭配，缓解气道敏感性引发呼吸道症状。另外，GERD患者体内相关炎症介质发生变化，特别是促炎因子，现已证明其与GERD的发生、发展密切相关。GERD食管黏膜中 IL-1β、IL-6、白细胞介素-8(IL-8)、血小板活化因子(PAF)和活性氧自由基(ROS)等促炎细胞因子表达水平增加。胃十二指肠内容物包括酸、胆盐、胰蛋白酶等侵蚀食管和气管上皮，促炎介质持续高表达便可引起食道、气管病变，出现GERD相关症状及并发症。白细胞介素-1(IL-1)为促炎细胞因子，构成免疫系统重要组成部分，存在白细胞介素-1α(IL-1α)和白细胞介素-1β(IL-1β)2个亚型，IL-1是多种细胞激活剂，其表达水平的升高可增加肠道、皮肤和其他器官炎性疾病[18]。动物模型和临床试验中，回流引起的食管黏膜炎症中IL-1β有所增加。IL-6是来源于单核巨噬细胞及淋巴细胞发挥多种生物效应的细胞因子，它与炎症反应的发生密切相关，组织损伤或感染可引起IL-6的释放，后者诱导急性炎症的蛋白质合成。TNF-α可刺激并诱导中性粒细胞产生ROS，与酸反流时食道黏膜发生过氧化反应相关。研究显示，在反流性食管炎演化为Barret′s食管过程中，TNF-α可能起到了一定作用[19]。TNF-α可激活核因子κB (NF-κB)，后者是炎症和癌症发生过程中关键的调节信号分子。GERD患者的TNF-α表达和NF-κB显著增加[20]。LPCAT2是一种有效的磷脂类促炎介质和趋化因子，特别是对嗜酸性粒细胞有明显的趋化作用，能增强嗜酸性粒细胞黏附于血管内皮细胞，可激活多种免疫细胞，促使自身分泌及其他炎症介质的释放，包括ROS。在GERD发病机制的研究中，ROS发挥关键作用，研究认为GERD是由于胃内容物反流使黏膜上皮细胞出现ROS并发生氧化应激，导致黏膜损害[21]。在食管炎模型和慢性食管炎患者中，酸接触后的食管黏膜产生并释放的LPCAT2增加。前期研究表明，一枝蒿提取物具有改善胃肠动力、调节胃酸分泌、促进胃动力的作用[10]。另外，一枝蒿具有明显的抗炎、抗变态反应作用，对急、慢性炎症及炎性渗出均有明显的抑制作用，这与GERD“病在脾胃，胃失和降”引起的胃酸过多、消化不良，以及“浊气上逆，痰浊”引起的气道高反应和呼吸系统并发症表现的炎症、变态反应症状相适应[10]。综上所述，一枝蒿提取物可改善大鼠GERD所致的气道高反应，降低GERD大鼠的炎症因子表达，起到治疗GERD的作用。