高效液相色谱法测定熏烧烤肉制品中 苯并（a）芘的不确定度评定

◎ 王璟秋

（安徽省食品药品检验研究院食品检验所，安徽 合肥 230051）

熏烧烤肉制品是指以畜禽肉或其可食副产品等为主要原料，配以调味料（含食品添加剂），经腌（卤）、煮等工序进行前处理，再以烟气或蒸汽或火苗或其他热介质进行熏烤或烧烤等工序制成的熟肉制品[1]，常见的有烤鸭、熏鸡、烟熏火腿等。食物在熏制、烘烤过程中，蛋白质、脂肪、碳水化合物等在高温条件下发生一系列裂解反应，再经过环化和聚合反应等产生以苯并（a）芘为代表的多环芳烃类物质[2]。苯并（a）芘是多环芳烃中具有代表性的毒性最大的一种强致癌物[3]，也是熏烧烤肉制品中最常检出、毒性最强的物质[4]，其有很强的生物毒性和致癌性、致突变性及间接致畸性，是世界排名前三的致癌物质之一[5-6]。据流行病学调查，长期食用熏烧烤制食品与某些癌症发病有一定关系，如冰岛居民爱吃烟熏食品，被认为是造成其胃癌发生率高居世界第3 位的主要原因，日本居民爱吃炭火烤鱼，也在一定程度上造成了其胃癌的高发生率[7]。

熏烧烤肉制品中苯并（a）芘含量是涉及食品安全的重要指标，我国《食品国家安全标准 食品中污染物限量》明确规定熏烧烤肉制品中苯并（a）芘不得超过5 μg·kg-1[8]，本文采用GB 5009.27—2016 中的方法[9]，利用高效液相色谱荧光法检测熏烧烤肉制品中苯并（a）芘的含量，并依据JJF 1059.1—2012[10]对实验过程中各因素产生的不确定度进行评定，找出影响较大的因素，建立一套合理完整的评定方案。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

LC-20AD 高效液相色谱仪（日本岛津公司）、AT100 梅特勒电子天平（精度0.1 mg，梅特勒-托利多公司）、GVA50A 氮吹仪（美国Organomation 公司）和苯并（a）芘分子印迹柱（天津博纳艾杰尔科技有限公司）。

正己烷、二氯甲烷、乙腈（色谱纯）以及苯并（a）芘标准品（批号：GBW（E）080476，4.95 μg·mL-1，中国计量科学研究院）

1.2 样品前处理

按照GB 5009.27—2016对熏烧烤肉制品中苯并（a）芘含量进行检测：将肉制品试样预处理后，称取1.0 g（精确到0.001 g），加入正己烷，旋涡混合0.5 min，40 ℃下超声提取10 min，4 000 r·min-1离心5 min，取上清液再重复提取一次，合并上清液，转移进已活化后的苯并（a）芘分子印迹柱，经淋洗、收集、氮吹后，准确吸取1 mL 乙腈涡旋复溶，过微孔滤膜供测定。

1.3 高效液相色谱分析条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse PAH，4.6 mm×250 mm×5 μm，柱温：35 ℃；荧光检测器：激发波长384 nm，发射波长406 nm；流动相比例：乙腈∶水（88 ∶12）；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。

1.4 标准溶液的配制

移液管准确移取2 mL 标准品（浓度4.95 µg·mL-1），置于10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即成浓度为0.99 µg·mL-1的标准中间液。将标准中间液用乙腈逐级稀释配制成浓度为1.98 ng·mL-1、3.96 ng·mL-1、7.92 ng·mL-1、9.90 ng·mL-1和19.80 ng·mL-1的标准工作溶液。

1.5 数学模型的建立

根据GB 5009.27—2016 的测定方法及结果计算，待测物苯并（a）芘的含量按公式（1）计算。

式（1）中，X-样品中待测物苯并（a）芘的残留量，单位为µg·kg-1；C-由标准曲线得到的样品中苯并（a）芘浓度，单位为ng·mL-1；V-氮吹后最终定容体积，单位为mL，实验中V=1 mL；m-待测样品的称样量，单位为g；1 000-由ng·g-1换算成µg·kg-1的换算因子。

因实验中产生的各种随机因素会对测量结果有一定影响，故在测量模型中加入重复性系数frep，建立样品中苯并（a）芘含量不确定度测量模型，即：

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

根据试验过程和测量模型可看出，影响测定结果不确定度urel(X)的主要因素有：①由标准曲线得到的样品中苯并（a）芘浓度引入的不确定度urel(C)。②氮吹后最终定容体积引入的不确定度urel(V)。③样品称量引入的不确定度urel(m)。④样品前处理及仪器进样的重复性引入的不确定度urel(frep)。⑤回收率产生的不确定度urel(R)。因此，试样中苯并（a）芘的残留量的相对标准不确定度urel(X)可由式（3）计算。

2.2 由标准曲线得到的样品中苯并（a）芘浓度引入的不确定度urel(C)

该过程的不确定度由3 部分组成：①标准物质引入的不确定度urel(C1)。②制备标准曲线产生的不确定度urel(C2)。③标准曲线拟合过程产生的不确定度urel(C3)。

2.2.1 标准物质本身纯度引入的不确定度urel(C1)

由供应商提供的标准品证书可知，苯并（a）芘标准品浓度为4.95 μg·mL-1，其相对扩展不确定度在k=2 情况下为2.5%，服从正态分布，则相对标准不确定度

2.2.2 制备标准曲线产生的不确定度urel(C2)

制备标准曲线产生的不确定度urel(C2)包括配制标准中间溶液引入的不确定度urel(C21)和制备标准工作液引入的不确定度urel(C22)。

（1）配制标准中间液引入的不确定度urel(C21)。苯并（a）芘标准品浓度为4.95 µg·mL-1，用2 mL 移液管移取标准品至10 mL 容量瓶并用乙腈定容，将其配制为0.99 μg·mL-1的中间液，配制过程中使用的移液管和容量瓶均会引入一定的不确定度，按照《常用玻璃量具检定规程》（JJG 196—2006）给出的不同计量器具的允许差δ，按照正态分布计算，标准不确定度u=δ/，相对标准不确定度urel=u/V。

2 mL 移液管最大允许误差为±12 µL，则移液管引入的相对标准不确定度为：

10 mL 容量瓶最大允许误差为±0.02 mL，则容量瓶引入的相对标准不确定度为

因此，配制标准中间液引入的不确定度为：

（2）制备标准工作溶液引入的不确定度urel(C22)。分 别 取20 µL、40 µL、80 µL、100 µL 和200 µL 体积的标准中间液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，分别配制成浓度为1.98 ng·mL-1、3.96 ng·mL-1、7.92 ng·mL-1、9.9 ng·mL-1和19.8 ng·mL-1的标准工作溶液，配制过程中的移液器和10 mL 容量瓶均引入了一定量的不确定度。

①移液器引入的不确定度。测量过程中分别使用20 µL、100 µL 和200 µL 量程的移液器，20 μL 移液器吸取20 μL 时容量允许误差±3.0%，100 μL 移液器吸取40 μL 时容量允许误差±3.0%，100 μL 移液器吸取80 μL 时容量允许误差±2.0%，100 μL 移液器吸取100 μL 时容量允许误差±2.0%，200 μL 移液器吸取200 μL 时容量允许误差±1.5%，按照均匀分布计算，则相对标准不确定度为：

②10 mL 容量瓶引入的不确定度。10 mL 容量瓶的相对标准不确定度计算方式同2.2.2 中（1），5 个10 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度为：

故配制标准工作液引入的不确定度为：

则制备标准曲线产生的不确定度

2.2.3 标准曲线拟合过程引入的相对标准不确定度urel(C3)

分 别 测 定 浓 度 为1.98 ng·mL-1、3.96 ng·mL-1、7.92 ng·mL-1、9.90 ng·mL-1和19.80 ng·mL-1的标准工作溶液，每一浓度分别测定2 次。以上机标准工作液浓度Ci为横坐标，以得到的对应峰面积Ai为纵坐标，拟合求得标准工作曲线方程，测得相关数据见表1。

表1 苯并（a）芘回归直线测量结果表

样品经过6 次平行测定后，通过拟合直线求出浓度C0，根据公式（1）计算出样品中所含苯并（a）芘残留量X0，按（4）式计算拟合曲线的标准不确定度u(C3)：

式中，Ai-标准工作溶液各点的待测物峰面积测定平均值；Ci-标准溶液的浓度值；b-拟合直线的斜率；a-拟合直线的截距；n-标准溶液测定次数，本实验中n=5×2=10；p-样品测试次数，本实验中p=6；C0-由线性方程计算求得的待测物浓度平均值；

则拟合标准曲线导致的相对标准不确定度urel(C3)=u(C3)/C0，有关量值见表2。

表2 苯并（a）芘标准曲线拟合的不确定度计算的有关量值表

则待测物苯并（a）芘浓度引入的不确定度：

2.3 定容体积的相对标准不确定度urel(V)

净化液氮吹近干后，用1 mL 移液管吸取1 mL 乙腈定容，1 mL 移液管移取溶剂，允许误差为±6.0 µL，按均匀分布计算，则定容体积引入的相对标准不确定度为：

2.4 称量样品的相对标准不确定度urel(m)

称量样品的天平最大允许误差为±5 mg，采用均匀分布，则称量样品的相对标准不确定度为：

2.5 实验合成重复性的相对标准不确定度urel(frep)

按实验方法平行测定样品6 次，测得样品待测物含量为X1～X6，见表3。计算待测物含量的平均值=2.708µg·kg-1，标准偏差S()=0.116 1，不确定度，则由实验重复性引起的相对标准不确定度为

表3 待测物含量和重复性相对标准不确定度urel(frep)计算结果表

2.6 回收率产生的不确定度urel(R)

对空白样品试样中添加浓度水平3.0 µg·kg-1标准工作液，平行测定6 次，结果见表4。计算得：

平均回收率=87.6，标准偏差S(R)=1.216，不确定度u(R)=S(R)/=0.4 964，相对不确定度

表4 样品添加回收率表

2.7 不确定度测定结果

苯并（a）芘的合成不确定度为：

取扩展因子k=2，置信概率p=95%，则扩展不确定度U=urel(X)×2×，故得到熏烧烤肉制品中苯并（a）芘的含量结果，详见表5。

表5 熏烧烤肉制品中苯并（a）芘检测结果表

3 结论

本实验采用高效液相色谱法测定熏烧烤肉制品中的苯并（a）芘含量，并经过分析和比较各因素引入的不确定度大小来进行不确定度评定，通过试验中各因素的不确定度来源和结果可知，标准曲线拟合过程引入的不确定度最大，其次是重复性测定，其他因素引入的不确定度相对较小。因此在标准溶液配制过程中应选择精密度高的器具，定期维护并校准相关仪器设备，使其保持良好的工作状态，规范操作，提高人员技能，减少人为误差，以提高测定结果的可靠性和准确性。