铁皮石斛复方胶囊中甘露糖的含量检测方法研究

◎ 徐晨宇，宋莹利，王卫茜，秦 雯，王 丹

（1.北京城市学院，北京 100083；2.北京采瑞医药科技研究院有限公司，北京 100094）

铁皮石斛复方胶囊是由铁皮石斛、桑叶、葛根等中药经过适当工艺加工而成的具有辅助降血糖功能的保健食品。其中，铁皮石斛具有养阴益胃、生津止渴的功效，常在中药方剂中用于治疗糖尿病[1]。现代药理研究表明铁皮石斛具有降血糖的作用。有实验研究表明铁皮石斛的水提取物对链脲霉素（Streptozotocin，STZ）所致的糖尿病小鼠有显著的降血糖功效，其效果与对照药物盐酸二甲双胍相近；同时能通过调节糖尿病小鼠血脂，改善其脂代谢，间接维护了血糖水平的稳定[2]。吴妹等研究发现，铁皮石斛对肾上腺素性高血糖小鼠及链脲佐菌素性糖尿病大鼠有明显的降血糖作用。其降血糖的胰腺内机制是促进胰岛B 细胞分泌胰岛素，抑制胰岛A 细胞分泌胰高血糖素，胰腺外机制可能是抑制肝糖原分解和促进肝糖原合成。铁皮石斛中主要含有多糖、生物碱、菲类等化合物，其中多糖是铁皮石斛中一类重要的活性物质，组成以甘露糖为主且含量较高，与降血糖、增强机体免疫机能等有着密切的关系。糖类化合物在紫外区无吸收，多采用示差折光检测器检测，但示差折光检测器灵敏度低，且不能用于梯度洗脱[3]。通过衍生使糖类化合物转变成具有紫外吸收或可产生荧光的物质是提高糖类HPLC 检测灵敏度的主要手段[4]。本研究先将铁皮石斛多糖水解成单糖，并与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）进行衍生化后，再采用HPLC 法测定铁皮石斛复方胶囊中甘露糖的含量，旨在为铁皮石斛复方胶囊品控提供一种有效的质量控制手段[5-7]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

铁皮石斛复方胶囊（批号：19050122、19050222、19050322），中试样品。

乙腈（色谱纯，批号：75-05-8，寒默飞世尔科技有限公司）、甘露糖对照品（批号：C16J8H28561，含量：≥98%，上海源叶生物科技有限公司）、内标盐酸氨基葡萄糖（批号：S27M7I15344，含量：≥98%，上海源叶生物科技有限公司）以及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，分析纯，上海源叶生物科技有限公司）；水为哇哈哈纯净水；甲醇、乙醇、三氯甲烷，均为分析纯。

Waters2695 液相色谱仪（2487 紫外灯检测器，沃特世公司）。

1.2 对照品溶液的制备

校正因子测定：取盐酸氨基葡萄糖适量，精密称定，加水制成12 mg·mL-1的溶液，作为内标溶液。另取甘露糖对照品约10 mg，精密称定，置于100 mL 量瓶中，精密加入内标溶液1 mL，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取400 μL，加0.5 mol·L-1的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液与0.3 mol·L-1的氢氧化钠溶液各400 μL，混匀，70 ℃水浴反应100 min。再加0.3 mol·L-1的盐酸溶液500 μL，混匀，用三氯甲烷洗涤3 次，每次2 mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液10 μL，注入液相色谱仪，测定，计算校正因子（f）[8]。

1.3 供试品溶液的制备

取混合均匀的样品0.700 g（精确至0.001 g），置索氏提取器中，加80%乙醇适量，加热回流提取4 h，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，滤纸筒拆开置于烧杯中，加水100 mL，再精密加入内标溶液2 mL，煎煮1 h 并时时搅拌，放冷，加水补至100 mL，混匀，离心，吸取上清液1 mL，置顶空瓶中，加3.0 mol·L-1的盐酸溶液0.5 mL，封口，混匀，110 ℃水解1 h，放冷，用3.0 mol·L-1的氢氧化钠溶液调节pH 值至中性，吸取400 μL，参照校正因子测定方法，自“加0.5 mol·L-1的PMP 甲醇溶液”起，依法操作，取上清液注入液相色谱仪，测定，即得。

1.4 色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Agilent EclipseXDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈∶0.02mol·L-1乙酸铵溶液（17 ∶83，v/v）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：250 nm；进样量：10 μL，温度：室温。

1.5 甘露糖含量测定的方法学考察

1.5.1 专属性考察

参考铁皮石斛复方胶囊的处方比例，适量称取处方中的药材去除铁皮石斛，按照1.2 的溶液制备流程，利用同样的方式来制备阴性对照溶液。分别吸取对照品、供试品和缺铁皮石斛复方胶囊阴性对照溶液各10 μL，分别进样，进行色谱测定。

1.5.2 标准曲线绘制

称取盐酸氨基葡萄糖8.34 mg，置于10 mL 容量瓶中，加水制成0.834 mg·mL-1的溶液，作为内标溶液。另取甘露糖对照品10.77 mg，置于25 mL 容量瓶中，加水制成0.430 8 mg·mL-1的甘露糖对照品母液。分别精密吸取上述甘露糖对照品母液0.50 mL、1.00 mL、3.00 mL 和4.00 mL、5.00 mL 至10 mL 容量瓶中，分别加入上述内标溶液1.0 mL，加水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为21.54 μg·mL-1、43.08 μg·mL-1、129.24 μg·mL-1、172.32 μg·mL-1和215.40 μg·mL-1的对照品系列溶液，各吸取400 μL，加0.5 mol·L-1的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液与0.3 mol·L-1的氢氧化钠溶液各400 μL，混匀，70 ℃水浴反应100 min。再加0.3 mol·L-1的盐酸溶液500 μL，混匀，用三氯甲烷洗涤3 次，每次2 mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液10 μL，注入液相色谱仪，按规定的色谱条件进样，记录峰面积。以对照品质量浓度为横坐标（X），对应的峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得到标准曲线方程。

1.5.3 精密度实验

精密吸取甘露糖对照品溶液，按照对照品溶液制备方法进行处理，在规定的色谱条件下连续进样6 次，记录峰面积，并计算RSD值。

1.5.4 重复性实验

取同一批次铁皮石斛复方胶囊6 份，分别按照供试品溶液制备方法进行溶液制备，在规定的色谱条件下进样，记录峰面积，并计算RSD值。

1.5.5 稳定性实验

精密吸取同一供试品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h 和48 h 进样，记录目标峰的峰面积，并计算RSD值。

1.5.6 加标回收率实验

取适量已知甘露糖含量的铁皮石斛复方胶囊内容物6 份，精密称定，分别加入已知含量100%的甘露糖，按照供试品溶液制备方法进行溶液制备，在规定的色谱条件下进样，记录甘露糖峰面积，计算甘露糖的回收率。

1.5.7 样品含量测定

取3 批铁皮石斛复方胶囊，每批取2 份，每份精密称定1 g，按照供试品制备方法制备供试品溶液，在规定色谱条件下进样，记录色谱峰面积，计算甘露糖的含量。

2 结果与分析

2.1 专属性实验

依据本产品配方中药材的功效成分和特征，确定选择测定的成分为甘露糖。如图1 所示，色谱峰分离度良好，且阴性对照溶液对甘露糖的测定无干扰，表明本法专属性强。经方法验证，选择的成分检测方法成熟稳定可靠，可以用于控制产品质量。

图1 甘露糖专属性实验结果图

2.2 线性关系考察

结果如图2 所示， 甘露糖对照品浓度在21.54 ～215.40 μg·mL-1线性关系良好，相关系数R²=0.999 9，回归方程为Y=17 184X+15 290。

图2 甘露糖对照品标准曲线图

2.3 仪器精密度考察

供试品按照色谱条件重复进样6 次，实验结果如表1 所示，甘露糖对照品峰面积RSD为0.22%，内标峰面积RSD为0.40%，符合RSD≤3%的要求，表明该方法的仪器精密度良好。

2.4 重复性考察

表2 重复性实验结果表明，6 份样品甘露糖的平均含量为3.62 g/100 g，RSD值为2.31%，符合《中华人民共和国药典》中关于重复性的规定，表明本方法重复性良好，符合要求。

2.5 加标回收率实验

表3 加标回收率实验结果表明，分别加入已知含量100%的甘露糖标准品后的加标回收率在95.90%～102.97%，平均回收率为100.34%，RSD为2.46%，符合《中华人民共和国药典》的规定，加标回收率实验符合要求。

表1 仪器精密度考察表

表2 重复性考察表

表3 加标回收率实验考察表（n=6）

2.6 样品测定

选取铁皮石斛复方胶囊小试样品，按1.3 方法处理样品，按1.4 色谱条件测定，计算含量，结果见表4。

表4 样品测定表

3 结论与讨论

铁皮石斛中富含多糖，有研究表明其为发挥降血糖作用的主要有效物质[9]，但铁皮石斛多糖的成分复杂，提取纯化过程繁琐，并且在紫外区无吸收，因此直接采用紫外分光光度法或高效液相色谱法测定挑战大，且方法不稳定。甘露糖是铁皮石斛中多糖的主要组成成分，因此在多糖研究基础上，将多糖充分水解为甘露糖，利用甘露糖作为含量检测指标，能间接客观地评价铁皮石斛复方胶囊的质量，为建立铁皮石斛复方胶囊的质量标准研究提供参考依据[10]。甘露糖在紫外区也无吸收，目前对甘露糖等糖类成分多采用示差折光检测器，但示差检测器灵敏度较低，且不能梯度洗脱。本实验通过衍生化使糖类化合物转变为具有紫外吸收的物质，提高甘露糖检测的灵敏度。经PMP衍生化的甘露糖，在250 nm 处有强烈的吸收，且衍生产物结构稳定，不易分离，分析时其他杂质干扰小[11-13]。

本实验采用药典方法发现PMP 的峰和甘露糖的峰无法分开，有相互干扰，在参考药典方法的基础上对方法进行了改进，经改进后，能够较好地分离色谱峰，且阴性样品对结果不造成干扰，本实验中线性回归曲线、检出限、仪器精密度、重复性及回收率均符合要求，说明此方法的色谱条件与系统适用性良好，给铁皮石斛复方胶囊的质量控制提供了参考[14-17]。