辣木籽残渣提取物抗氧化性研究

◎ 姚子升，朱惠绵，韩诗蕾，黄纪国

（1.广州市食品检验所，广东 广州 510000；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东 广州 510000；3.广东广业清怡食品科技有限公司，广东 广州 510000；4.广东轻工职业技术学院，广东 广州 510000）

辣木（Moringa oleiferaLam.）属于辣木科、辣木属植物，原产于印度北部的喜马拉雅地区，是耐旱性及适应性较强的速生树种[1-2]，其根具有辛辣味，因此得名为辣木[3]。辣木主要分布于亚洲、非洲和中美洲的热带、亚热带国家或地区。辣木籽油是从辣木种子中提取出的一种植物油脂，其在种子中的含量高达38%～45%，是一种安全且经济价值较高的油料[4]。辣木籽中含有大量的油脂、维生素、蛋白质、多糖、可溶性纤维、黄酮及多酚类化合物[5]，是一种营养丰富的食物[6]。辣木籽油含有大量单不饱和脂肪酸，具有良好的抗氧化性、耐煎炸性，是一种食品安全级很高的食用油脂[7-8]，更是一种可与茶油、橄榄油相媲美的高档植物油[9]。

鉴于辣木独特的食用功能和药用价值，近年来，其作为新型非传统食品来源的研究已在国内外引起诸多关注，辣木开发主要集中在功能食品的开发、饲料、水的净化、化妆品原料及植物生长促进剂和杀菌剂等方面[10-11]，主要集中在辣木籽的油脂、蛋白质的提取方法及其理化性质的初步研究[12]，以及辣木籽油在食品、化工领域的应用基础研究[13-14]。关于辣木籽残渣的提取方法与应用等方面的综述少见报道，目前仅有对辣木籽油的特点及食药用价值方面的研究概述[15]，有关辣木籽残渣提取物的利用和功效的影响，以及辣木籽残渣在功能性食品应用研究的综述尚未见探讨。因此，本文从辣木籽残渣提取物的活性上进行了概括与探讨，旨在更好地为辣木籽残渣的深入研究及相关产品的开发应用提供理论支持与借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料与试剂

辣木籽，产自云南昆明，购自云南昆明辣木生物科技有限公司，经过去壳后，60 ℃烘干至恒重，粉碎过80 目筛后保存待用。

95%乙醇；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼；无水乙醇、没食子酸﹑无水碳酸钠，均为国产分析纯；1 mol·L-1福林酚试剂，为南京奥多福尼生物科技有限公司生产；乙酸乙酯为国产分析纯，广州试剂三厂生产。

1.1.2 仪器与设备

DZF-150 型数显小型真空干燥箱和SHB-Ш 型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、TGL-168 型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、AR-1140/C 型电子分析天平（上海金鹏分析仪器有限公司）、RE-52A 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）、恒温水浴锅（上海霄汉实业发展有限公司）、超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）、微量连续可调移液器（上海江岳电子科技有限公司）及HB120-50-05型超临界提取装置（江苏宏博机械制造有限公司）。

1.2 辣木籽残渣提取物的制备

烘干后的辣木籽经干燥粉碎后，均匀装入5 L 超临界提取罐中，采用段琼芬等人的方法[8]进行提取辣木籽油（提取6 次，每次4 h），将收集提取的辣木籽油低温保存备用，将CO2超临界提取过后的辣木籽残渣挥发干净，先后依次采用用乙酸乙酯（液质比1 ∶25）、水（液质比1 ∶25）进行超声浸提（提取2 次，每次0.5 h），过滤；滤液经真空减压浓缩干燥，依次得到乙酸乙酯提取物，水提取物。最终，将辣木籽油，乙酸乙酯提取物和水提物低温保存。

超临界二氧化碳萃取法：段琼芬等用超临界CO2流体萃取辣木籽油，得到最佳提取条件为：萃取温度35 ℃，分离温度40 ℃，CO2流量为20 kg·h-1，萃取压力20 MPa，出油率为36.3%，提取率为97%[16]。

1.3 实验步骤

在辣木籽粉的提取物中，Singh 等[17]发现游离和结合形式的酚类物质存在，且通过不同的体外实验，综合1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力、铁还原抗氧化能力及总抗氧化能力来验证其抗氧化活性。

1.3.1 对DPPH 自由基清除活性的测定

参考鲁俊华等[18]的方法，并做出部分修改。200 μmol·L-1DPPH 溶液的配制：称取19.7 mg 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，95%乙醇在250 mL 容量瓶定容。样液配制：乙酸乙酯提取物，水提取物以及超临界萃取物均以50%乙醇分别配制质量浓度为10 mg·mL-1、8 mg·mL-1、6 mg·mL-1、4 mg·mL-1和2 mg·mL-1的溶液。

向2 mL 的DPPH 溶液中加入不同浓度的2 mL 样品溶液，室温下避光反应30 min 后，517 nm 检测吸光值A1。向2 mL 的DPPH 溶液中加入2 mL50%乙醇溶液，室温下避光反应30 min 后，517 nm 检测吸光值A2。向2 mL 的95%乙醇溶液中加入不同浓度的2 mL样品溶液，室温下避光反应30 min 后，517 nm 检测吸光值A3。按式（1）计算其清除率。

式（1）中，A2=0.675 3，A3=1.010 1。

1.3.2 对羟基自由基（OH·）清除活性的测定

参考金鸣等[19]的方法：1.865 mmol·L-1邻二氮菲溶液配制：称取0.185 g 邻二氮菲粉末用无水乙醇溶解定容至500 mL。1.865 mmol·L-1的FeSO4·7H2O 溶液配制：称取0.259 g 的FeSO4·7H2O 粉末用水定容至500 mL。配 制0.2 mol·L-1的pH7.4 的PBS 以 及0.03%（v/v）的H2O2。 取1.0 mL 浓 度 为1.865 mmol·L-1邻 二 氮菲的无水乙醇溶液于带塞试管中，分别加入浓度为0.2 mol·L-1的pH7.4 磷酸盐缓冲液2 mL 和1 mL 不同浓度的样品，充分混匀后加入1.0 mL 浓度为1.865 mmol·L-1的FeSO4·7H2O 溶液，再次混匀后加入1.0 mL 0.03%（v/v）的H2O2，于37 ℃恒温水浴，60 min 后，在536 nm 下分别测量各组混合溶液的吸光度值得A1。以磷酸盐缓冲液代替样品作为损伤组测吸光度值得A2。以磷酸盐缓冲液替代样品和H2O2作为未损伤组，测其吸光度值A3。按式（2）计算其清除率。

式（2）中，A2=0.675 3，A3=1.010 1。

1.3.3 对超氧自由基清除活性的测定

参考林祥潮等[20]的方法。30 mmol·L-1邻苯三酚溶液配制：准确称取0.189 2 g 邻苯三酚，用10 mmol·L-1的盐酸溶液溶解后，定溶于50 mL 容量瓶，需现配。Tris-HCl 缓冲液（pH9.0）：将50 mL 0.1 moL·L-1Tris溶液与7.0 mL 0.1 mol·L-1盐酸溶液混合，加水稀释至100 mL。天青Ⅰ溶液：2.0×10-4mol·L-1。取两支试管，分别加入2 mL 天青Ⅰ溶液和0.6 mL 的Tris-HCl 缓冲液，向其中一支加入0.4 mL 的邻苯三酚溶液作为阳性对照组，另一只不加邻苯三酚作为阴性对照组，加水定容至10 mL。室温下反应10 min。在602 nm 处测定体系的吸光度，阴性对照组为A0，阳性对照组为A1，超氧自由基的产生量可由∆A=A0-A1表示。

按照以上步骤，加入天青Ⅰ和缓冲液后，再向其中加入1 mL 的不同浓度的样品溶液，再加入0.4 mL邻苯三酚溶液，定容至10 mL。室温下反应10 min，测其吸光值A2。按式（3）计算其清除率。

式（3）中，A0=0.255 2，A1=0.139 7。

2 结果与分析

2.1 辣木籽残渣提取物对DPPH 自由基的清除作用

DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其孤对电子在517 nm 波长处有最大吸收，因此其可与抗氧化活性物质结合，使其在517 nm 波长处的吸收消失或减弱[21]。根据表1 数据得辣木籽残渣提取物清除DPPH 自由基的浓度-清除率关系。说明各种样品所建立的方程非常可靠，解释了辣木籽提取物浓度与清除率之间一一对应关系。由图1 可知，水相提取物的DPPH 自由基清除率随浓度上升而增大，乙酸乙酯相提取物对DPPH 的清除率明显高于水相，在浓度为6 mg·mL-1时达到最大值，清除率为97.14%。

表1 辣木籽残渣提取物对DPPH 自由基的清除率表

图1 辣木籽残渣各提取物对DPPH 自由基的清除率图

2.2 辣木籽残渣提取物对羟自由基的清除作用

邻二氮菲-Fe2+作为一种常用的氧化还原指示剂，可与H2O2作用产生羟自由基，通过指示剂颜色的变化判断待测物质的羟自由基清除作用[21]。根据表2 数据得辣木籽残渣提取物清除羟自由基的浓度-消除率关系。从表2 可以看出，各实验组的羟自由基清除率和浓度呈正相关，而水相提取物的羟自由基清除能力大于乙酸乙酯相，这与本实验其他结果抗氧化性不一致，这可能与辣木籽残渣提取物本身的化学结构有关，不同结构的物质对不同体系和不同自由基的作用存在一定的选择性。图2 说明各种样品所建立的方程可行，且非常可靠，能较好的解释辣木籽提取物清除羟基自由基的浓度-清除率关系。

表2 辣木籽残渣提取物对羟基自由基的清除率表

图2 辣木籽残渣各提取物对羟自由基的清除率图

2.3 辣木籽残渣提取物对超氧自由基的清除作用

邻苯三酚在碱性溶液中的自氧化反应产生超氧阴离子自由基，可迅速氧化指示物质天青I 使其褪色，通过溶液吸光度的变化测定物质的超氧自由基清除能力[22]。根据表3 数据得辣木籽残渣提取物清除超氧自由基的浓度-清除率关系。结果表明，各实验组的清除超氧自由基的能力随着样品浓度的升高而增加，其中乙酸乙酯相对超氧自由基的清除能力最强，当浓度达到8 mg·mL-1时，对超氧自由基的清除率达到95.50%。图3 说明各种样品所建立的方程可行，解释了辣木籽残渣提取物的浓度与超氧自由基清除率之间的一一对应关系。

表3 辣木籽残渣提取物对超氧自由基的清除率表

图3 不同组分辣木籽提取物对超氧自由基的清除能力图

3 结论

本研究分别测定了辣木籽残渣提取物对DPPH 自由基、羟基自由基、超氧自由基的清除能力。结果表明，辣木籽残渣提取物对DPPH 自由基、羟基自由基、超氧自由基均有一定的清除能力，且随浓度的增大而逐渐增强，其中乙酸乙酯提取物的抗氧化活性最强，其对DPPH 自由基、羟基自由基、超氧自由基的清除率都较高。本研究为辣木籽残渣的深入研究及相关产品的开发应用提供了理论支持与借鉴，有望应用到功能性食品中，具有广泛的应用前景。