碱提法提取大球盖菇多糖工艺 及其清除氧自由基研究

◎ 钱春强，林文飞，吴德平，刘南亿

（1.宜兴市好禧虫草专业合作社，江苏 宜兴 214200；2.浙江大学生命科学学院食药用菌研究所，浙江 杭州 310058）

大球盖菇（Stropharia rugoso-annulata）又名皱环球盖菇、赤松茸、大红菇等，是一种营养丰富，口感细嫩的珍稀食用菌。大球盖菇具有较强的抗杂和抗逆能力，适种季节广，栽培过程中分泌的胞外纤维素酶可以很大程度上降解纤维素、木质素，可以利用多种农林废弃资源[1-3]。其栽培模式多样，栽培技术易于掌握，不需要复杂栽培设施，可以在林地和农闲田进行栽培[4]。栽培后的菌渣仍含有多种有机质，可作为肥料直接还田[5]，有利于改良土壤结构，增进土壤肥力，促进微生物活动和作物根系发育，同时在一定程度上缓解农林废弃资源到处堆放而造成的环境问题，有利于实现农业废物综合利用，具有较好的经济、生态和社会效益。

大球盖菇是我国20 世纪末从欧洲引进的一种珍稀食用菇种，被世界粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）评为最值得向发展中国家推荐的“营养、健康”菇种。大球盖菇子实体中含有丰富的蛋白质、多糖、纤维素、氨基酸及矿物质等多种营养物质，脂肪含量低，并含有牛磺酸、维生素C 等生物活性物质[6]。其中，多糖是食用菌中的主要活性成分之一，种类丰富，活性和含量较高，可以提高生物体的免疫力，具有抗氧化、抗癌、抗肿瘤等功效。大球盖菇碱性多糖主要以半乳糖为主，还有甘露糖，葡萄糖，阿拉伯糖组成的杂多糖[7]。

本文对大球盖菇碱性多糖的提取温度、时间和碱液浓度3 个因素进行优化，通过正交分析确定了其最佳提取工艺参数。本文通过过硫酸铵/N，N，N´，N´-四甲基乙二胺（AP/TEMED）体系检测大球盖菇碱性多糖对氧自由基（O2-·）的清除率，对大球盖菇碱性多糖的氧自由基清除作用进行了初步研究，为大球盖菇碱性多糖的生物活性研究提供了一定的数据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜大球盖菇，购自江苏宜兴当地市场；氢氧化钠、硫酸、重蒸苯酚、过硫酸铵（AP）、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、α－萘胺三羟甲基氨基甲烷（Tris），盐酸（HCl）及冰醋酸，均购自国药集团化学试剂有限公司；木瓜蛋白酶，购自Sigma 公司；N，N，N´，N´-四甲基乙二胺（TEMED）。

透析袋（分子量6 000 ～14 000）、UV-3802 型紫外/可见分光光度计（北京高能科迪科技有限公司）、R201-Ⅱ型旋转蒸发仪（瑞士Buchi 公司）、5430 R台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）以及真空冷冻干燥机（北京博医康仪器公司）。

1.2 多糖提取方法

1.2.1 预处理

新鲜的大球盖菇切片冻干后粉碎，置于真空干燥器内储藏。

1.2.2 水浴浸提

称取适量大球盖菇粉末置于烧杯中，根据需求按不同的水浴温度、浸提时间、碱液浓度进行热水浸提，在浸提过程中使用电动搅拌器对其进行不停地搅拌。得到浸提液进行抽滤、旋转蒸发浓缩，以便下一步处理。

1.2.3 除蛋白

对上述多糖进行脱蛋白处理，加入1%木瓜蛋白酶，60 ℃酶解4 h，再用Sevage法连续作用至溶液澄清，在波长280 nm 处无蛋白吸收峰即可[8]。

1.2.4 醇沉

加入80%无水乙醇（v/v），静置过夜后弃去上清液，收集沉淀，冷冻干燥后得到大球盖菇碱性粗多糖样品。

1.3 多糖得率测定方法

标准曲线：配制0.1 mg·mL-1葡萄糖标准溶液，分别量取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL，不足1 mL 的用蒸馏水补至1 mL。然后加1 mL 的5%苯酚、5 mL 浓硫酸，静置10 min。37℃水浴20 min 后在490 nm 测定吸光度A490。以蒸馏水做空白对照。

样品测定：吸去1 mL 多糖待测液，按照上述方法测定A490。多糖得率由标准曲线求得[9]。

1.4 单因素试验

以温度（40℃、55℃、70 ℃、85 ℃和100 ℃）、时间（0.5 h、1.0 h、2.0 h、3 h 和4 h）、碱液浓度（0.005 mol·L-1、0.010 mol·L-1、0.020 mol·L-1、0.030 mol·L-1和0.040 mol·L-1）等3 个主要因素，分别进行单因素试验来确定大球盖菇碱性多糖的最佳提取参数。

1.5 正交试验

采用L9（33）正交试验对上述单因素试验进一步优化设计，并进行方差分析确定该多糖提取的最佳工艺。试验因素和水平见表1。

表1 L9（33）正交试验因素和水平表

1.5.1 大球盖菇碱性多糖清除O2-·试验

过 硫 酸 铵/N，N，N´，N´- 四 甲 基 乙 二 胺（AP/TEMED）体系可以产生O2-·，而该O2-·能与羟胺溶液反应生成NO2-，后者经对氨基苯磺酸和α-萘胺显色在波长530 nm 处有特征吸收峰[10]。因此，本实验通过研究大球盖菇多糖对AP/TEMED 产生的O2-·的清除率来判断其抗氧化活性。AP/TEMED 溶液的配制参照表2。

表2 AP/TEMED 体系溶液配制表[11-12]

在室温条件下，吸取A 液0.4 mL，B 液1.6 mL于20 mL 具塞试管中混匀，反应1 min；分别加入0 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1和0.8 mg·mL-1的大球盖菇碱性多糖溶液1 mL、10 mmol·L-1的盐酸羟胺0.4 mL，振荡混匀，静置反应20 min；加 入17 mmol·L-1对 氨 基 苯 磺 酸2 mL 和7 mmol·L-1α-萘胺2 mL，震荡混匀，并反应25 min。用等体积的正丁醇对显色液进行萃取，4 000 r·min-1离心15 min，在530 nm 处测定有机相吸光度值。按式（1）计算O2-·清除率。

式（1）中，A-对照液的A530值；B-待测液的A530值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

由图1 可知，当提取温度为85 ℃时，多糖得率达到最高值，为6.29%，其中多糖得率随温度升高呈现先升高后下降的趋势，这是由于温度过高会引起多糖糖苷键断裂，多糖降解。

图1 提取温度对大球盖菇碱性多糖得率的影响图

由图2 可知，提取时间从0.5 h 提高到1.0 h，多糖得率增幅极大，当时间增加至2 h 时，多糖得率达到最高点，为6.21%。

图2 提取时间对大球盖菇碱性多糖得率的影响图

由图3 可知，随碱液浓度提高，多糖得率先增加后减小，并在碱液浓度为0.02 mol·L-1时，多糖得率达到峰值。

图3 碱液浓度对大球盖菇碱性多糖得率的影响图

2.2 多糖工艺的正交试验

在单因素试验的基础上，选定以下3 因素3 水平进行正交试验，其分析结果参见表3。

由正交实验结果和极差分析可知，影响大球盖菇碱性多糖得率的诸因素大小顺序是：温度（A）>碱液浓度（B）>时间（C），最佳组合为A2B3C3，即提取温度为85 ℃，碱液浓度为0.03 mol·L-1，提取时间为2 h。在此条件下，大球盖菇碱性多糖得率为6.98%。

2.3 正交试验的方差分析

为判断上述3 因素对试验结果的影响是否存在，将正交试验数据进行方差分析，找出其中起主导作用的变异来源，其结果见表4。

表3 正交试验结果表

表4 正交设计方差分析表

由表4 可知，3 个因素中提取温度对多糖得率具有极显著性影响（P<0.05），提取时间和碱液浓度的影响均不显著（P>0.1），其中，对多糖得率的影响最不显著的是提取时间，这与正交实验的结果相吻合。

2.4 大球盖菇碱性多糖对O2-·的清除作用

由表5 可知，大球盖菇碱性多糖对O2-·的清除作用呈浓度依赖性，在多糖浓度为0.8 mg·mL-1时，其清除率达到80.12%。因此，可以看出大球盖菇碱性多糖具有较好的O2-·清除作用，这和地鳖虫多糖相似[13]。

表5 多糖对O2-·的清除率表

3 结论

本实验通过正交实验设计以及方差分析，确定了大球盖菇碱性多糖的最佳工艺条件：浸提温度85 ℃，碱液浓度0.03 mol·L-1，提取时间2 h，在此工艺条件下，多糖得率达到6.98%。方差分析表明，浸提温度是影响大球盖菇碱性多糖得率的主要因素，而提取时间和碱液浓度的影响较小。对最佳工艺条件下提取的大球盖菇碱性多糖进行O2-·清除能力进行研究，发现其具有较好的O2-·清除作用，也即具有较好的抗氧化能力，至于其清除DPPH 和·OH 自由基的能力还有待进一步研究。本研究为大球盖菇的生物活性研究及产学研一体化奠定了基础。