酸奶中乳酸菌的分离、鉴定及性能研究

◎ 黄耀雄，甘祥武

（广州市微生物研究所有限公司，广东 广州 510663）

乳酸菌是指发酵糖类，主要代谢产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称[1]。乳酸菌有着相当长的安全使用历史，长期以来发酵产品中所使用的乳酸菌普遍被人们认为是安全（GRAS）菌种，并且它还与人以及动物肠道内生微生物群落存在着相互作用，产生益生作用，有益于人和动物的健康[2]。

酸奶是以鲜奶为原料，经过巴氏杀菌后，添加发酵剂发酵后再冷却灌装的一种发酵乳制品。而乳酸菌作为主要发酵剂，因其良好的发酵性能，以及益生功效在发酵食品行业中占有不可替代的位置。目前国内酸奶近几年发展迅速，自2013 年至2019 年，酸奶份额占整个乳品市场份额从15%上升至36%，市场潜力非常大，面对这样的形势，对酸奶中乳酸菌的研究已然成为了热点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验样品为一款来自手工制作的酸奶。

3%过氧化氢溶液、500 mL 新鲜脱脂乳、0.1 moL NaOH 溶液、1.6%溴甲酚紫、氯化钠、2%酚酞试剂、莫匹罗星锂盐、半胱氨酸盐酸盐和石蜡油，以上试剂均为国产分析纯；MRS 琼脂培养基、MRS 肉汤培养基、MC 琼脂培养基、糖发酵基础培养基和革兰氏染色液，以上培养基、试剂均购于北京陆桥技术股份有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒，购于北京艾德莱生物科技有限公司；TaqDNA 聚合酶，购于宝生物工程（大连）有限公司；PCR 扩增所需引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 仪器与设备

JE1002 型电子天平（上海蒲春计量仪器有限公司）、BXM-50KB 型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、LRH-250F 型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、3WLED 型光学显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）、HR50-ⅡA2 型生物安全柜（青岛海尔生物医疗股份有限公司）、2720 型PCR仪（美国Applied Biosystems 公司）、PowerpacTM 基础型电泳仪（美国BIO-RAD 公司）、AlphaImager EP通用型凝胶成像系统（美国Alpha Innotech 公司）及Z216 MK 型离心机（德国HERMLE 公司）。

1.3 酸奶中乳酸菌的分离、纯化及鉴定

1.3.1 菌种分离及纯化

按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35—2016）[3]对酸奶进行试验，分离并纯化出菌种。

1.3.2 菌种鉴定

（1）表型特征鉴定。包括菌落特征、色泽、质地；个体细胞形状、革兰氏染色、芽孢染色等。参照《临床微生物学诊断与图解》（第4 版）[4]的方法。

（2）生理生化特征鉴定。①生长试验。将配制好的培养基分装入试管中，灭菌后制成斜面。将分离菌种分别接入试管中，每种菌接4 管，其中3 管作为试验组，另外1 管作为对照组。将实验组置于15 ℃厌氧培养，对照组置于36 ℃厌氧培养，24 h 后观察其生长情况。②过氧化氢酶试验。将配制好的3%的过氧化氢溶液加入到分离菌种上，若有气体产生，则过氧化氢酶试验阳性，无气体生成则为过氧化氢酶试验阴性。③碳水化合物发酵试验。将配制好的糖发酵基础培养基，按0.5%的比例加入碳水化合物溶液，加棉塞，包扎，经121 ℃蒸汽灭菌15 min，冷却至室温。在生物安全柜上接种，每种分离菌种接种1 支碳水化合物发酵管，留1 支碳水化合物发酵管不接种菌作为空白对照，置于36 ℃厌氧培养24 h，每4 h 观察一次，并记录其生长情况。若培养基的颜色改变，则该菌种对这种碳水化合物产酸。本次试验使用的碳水化合物分别为：七叶苷、乳糖、海藻糖、棉子糖、蜜二糖、松三糖、甘露醇、山梨醇和水杨苷[5-7]。

（3）分子学鉴定。使用试剂盒提取分离菌种DNA，以之作为模板进行目的片段扩增，采用16S rDNA 通用引 物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’），在适宜的反应体系进行PCR 扩增，纯化后送样测序，扩增序列与NCBI 数据库中序列进行比对获得菌种号相关信息。根据菌种表型特征鉴定、生理生化特征鉴定、分子学鉴定对分离菌种进行判定。

1.4 酸奶中乳酸菌的性能鉴定

1.4.1 凝固试验

取新鲜脱脂乳10 mL。置于试管中，加棉塞，包扎后经121 ℃蒸汽灭菌20 min，冷却至室温。在MRS 肉汤培养基接种试验菌种，置于36 ℃厌氧培养12 h，重复活化1 ～3 代。将肉汤培养基分装于离心管中，在离心机2 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入适量0.9%氯化钠溶液，混匀，如上述操作重复3次后使用0.9%氯化钠溶液制备菌悬液，最终浓度在106CFU·mL-1左右。按照1%接种，每种分离菌种接3支试管，留1 支试管不接菌作空白对照，置于36 ℃厌氧培养24 h，经培养8 h 后每4 h 观察1 次，并记录其凝固情况[8]。

1.4.2 产酸试验

采用酸度滴定法，用吸管吸取5 mL 发酵乳于100 mL 的三角瓶中，加20 mL 蒸馏水混匀，加入2 ～3滴2%酚酞指示剂，用0.1 moL·L-1氢氧化钠溶液滴定至出现粉红色，1 min 不消失为止。对凝固试验中培养24 h 的发酵乳进行酸度测试，计算滴定酸度=（滴定消耗的0.l moL·L-1NaOH 毫升数）×20。

2 结果与分析

实验共分离出2 株菌种，分别标作A1、A2。

2.1 表型特征鉴定结果

通过对菌落进行观察，革兰氏染色后放在显微镜下观察，所得到的2 株菌种的形态特征如表1。由表1可知，分离菌种经培养后菌落特征差异较大，A1 菌种菌落白色、隆起、表面粗糙及边缘整齐，A2 菌种乳白色、凸起、表面光滑及圆形；镜检下均为革兰氏阳性菌，但菌体形态有所不同，A1 菌种的菌体均为杆状，单个或成双排列，而A2 菌种的菌体为球型，单个、成双或链状排列，符合《临床微生物学诊断与图解》（第4 版）中相关乳酸菌的描述，但还无法确定分离出的2株菌种，还需通过生理生化试验进一步确认。

表1 菌种的形态特征及镜检结果表

2.2 生理生化鉴定结果

由表2 可知，A1 菌种除乳糖试验为阳性外，其他试验均为阴性；A2 菌种除15℃生长、乳糖试验为阳性外，其他试验均为阴性，根据《临床微生物学诊断与图解》（第4 版）中相关乳酸菌的描述，A1、A2 菌种分别符合为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的生理生化试验的结果，还需通过分子学鉴定进一步确认。

2.3 分子学鉴定结果

A1、A2 菌种测序后与GenBank 数据库中的序列比对，从GenBank 数据库中的序列获得和该菌种序列相近种、属的16S rDNA 基因序列，其同源性如表3。根据表型特征鉴定结果、生理生化鉴定结果、分子学鉴定结果综合判断，样品中分离的A1、A2 菌种经鉴定分别为为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）。

表2 菌种的生理生化鉴定结果表

表3 菌种的分子学鉴定结果表

2.4 菌种的性能鉴定

本文通过凝固试验、产酸试验结果综合分析分离菌种的性能。由表4 可知，A1 菌种在12 h 出现凝固，在16 h 有乳清析出，培养24 h 后凝固分布不均匀，酸度达到92.3。A2 菌种在20 h 出现凝固，相比A1 菌种的慢，培养24 h 后有乳清析出，但凝固分布不均匀，酸度达到97.2，酸度与A1 菌种的相近。参照《食品安全国家标准 发酵乳》（GB 19302—2010）[9]，发酵乳的酸度≥70 °T，A1、A2 菌种均符合相关要求，但2 株菌种均产生乳清，可能与发酵条件或其他因素相关。通过对2 种菌种的凝固试验结果、产酸结果综合分析，2 株菌种的性能良好。

表4 菌种的性能鉴定结果表

3 结论与讨论

本实验对一款手工制备的酸奶中乳酸菌进行分离、纯化，采用了表型特征鉴定、生理生化鉴定和分子学鉴定，确保了菌种鉴定结果的准确性，分离出2 株乳酸菌，分别为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus bulgaricus）。对酸奶中乳酸菌的分离进行讨论，按照GB 4789.35—2016的方法可分离出不同属的乳酸菌，但样品中若存在多种型的乳杆菌、链球菌或双歧杆菌，通过传统的生理生化鉴定，不仅耗时长，对检测人员的能力要求比较高，也无法准确分离及鉴定出所有乳酸菌。目前对于产品中菌种的分析存在许多方法，如API 细菌鉴定系统、药敏鉴定系统、飞行时间质谱鉴定系统等，也能较好较快地提高工作效率。此外，从产品中分离乳酸菌，也一定程度上解决了乳制品工业（特别是实验室基础研究）菌种的来源问题，并且降低了生产成本、节约了开支。

通过对从酸奶中分离菌种的性能测试，可得知分离的2 株菌种的性能较好，可用于下一步的基础研究。酸奶制备过程中，嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种是一种共生关系，嗜热链球菌产甲酸促进保加利亚乳杆菌的生长，德氏乳杆菌保加利亚亚种产氨基酸促进嗜热链球菌的生长，二者产胞外多糖及产酸对酸奶质地形成有促进作用，故嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种混合发酵，可为酸奶的发酵生产提供很好的思路[10]。下一步，也可通过优化发酵条件生产各种特色的酸奶，从而满足市场上不同消费人群的口味需求。