microRNA 499在老年心衰病人中的表达及临床价值

程璐 关玉华 时学昆 周志强 姜少燕

心力衰竭(心衰)为复杂、多因素疾病，为多种心脏疾病发展的终末阶段，以心脏收缩、舒张障碍为主要病理特点，在老年群体中高发，且住院率、死亡率极高，对病人生命安全及正常生活影响巨大。心衰的诊断与治疗受到社会的广泛关注。microRNA是由22～25个核苷酸组成的内源性非编码单链RNA，参与机体细胞增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭等多种生理病理过程，在心血管系统疾病的发生与发展过程中发挥重要作用[1]。microRNA 499具有敏感的心肌特异性，极有可能成为心衰诊断的生物标志物，受到了研究者的注意[2]。本研究检测了老年心衰病人血清microRNA 499的表达水平，分析其与N末端B型利钠肽原(N terminal pro B type natriuretic peptide，NT-proBNP)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的关系，以期探讨血清microRNA 499在老年心衰诊断中的临床价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2018年1月至2019年7月我院老年心血管科收治的45例老年心衰病人作为老年心衰组；病人均符合心衰的诊断标准[3]，年龄≥60岁。排除标准：(1)合并肾病综合征、肺源性心脏病、先天性心脏病、糖尿病或血糖控制不佳、严重心律失常、风湿性心脏瓣膜病、扩张型和肥厚型心肌病的病人；(2)恶性肿瘤、急慢性感染病人；(3)自身免疫性疾病、血液系统疾病、脑血管疾病病人；(4)近3个月内有心肌梗死史者。其中男23例，女22例；年龄60～90岁，平均(72.5±5.6)岁；NYHA分级Ⅱ级21例，Ⅲ级16例，Ⅳ级8例。选取同期30例老年健康体检者为健康对照组，其中男15例，女15例；年龄60～88岁，平均(72.1±5.3)岁。2组病人性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究已经医院伦理委员会审查批准，所有研究对象及其家属均自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 Hcy、NT-proBNP检测：收集2组清晨空腹静脉血3 mL，分别置于含有EDTA抗凝剂的红色采血管内，4000 r/min离心5 min后，分离血清，借助全自动生化分析仪(贝克曼库尔特AU5800)及其配套试剂盒检测Hcy水平，采用电化学发光免疫分析仪(罗氏COBASe 601)及其配套试剂盒检测NT-proBNP水平，操作步骤均严格参照说明书。

1.2.2 microRNA 499表达水平检测：采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测microRNA 499在血清中的表达量。取待测定的血清，加入Trizol提取血液中的总RNA，用超微量分光光度计检测其纯度，计算RNA浓度；而后借助TaqMan miRNA逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。用cDNA进行实时荧光定量PCR，反应条件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；共45个循环。采用hs-nRNA U6(HmiRQP9001，GeneCopoeia)作为内参进行校正和标准化。用2-ΔΔCq法计算血清中microRNA 499的相对表达量，重复3次，取平均值。microRNA 499 正向引物序列：5′-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3′；microRNA 499反向引物：5′-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3′；U6内参正向引物：5′- GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；U6内参反向引物：5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2 结果

2.1 2组microRNA 499、Hcy、NT-proBNP水平比较 老年心衰组血清中microRNA 499表达水平、Hcy、NT-proBNP水平均明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组microRNA 499、Hcy、NT-proBNP的水平比较

2.2 心衰病人microRNA 499与Hcy、NT-proBNP水平的相关性 相关性分析结果显示，血清microRNA 499表达水平与Hcy、NT-proBNP水平呈正相关。

2.3 microRNA 499在心衰中的诊断价值 绘制ROC曲线后发现，microRNA 499诊断心衰的AUC为0.950，截断点为0.867，灵敏度为0.867，特异性为1。

3 讨论

microRNA能通过与真核细胞靶基因mRNA上的mRNA 3′-UTR互补配对来降低mRNA分子的稳定性，调节机体细胞的产生、增殖以及分化、凋亡等病理生理过程，参与心肌细胞的增生、纤维化以及细胞外环境改变等[4]。microRNA 499在心衰诊断方面具有较明确的心肌特异性、敏感性，且其不受病人年龄、性别、肾功能、血脂水平等的影响，稳定性高，引起心衰研究人员的高度重视[5-6]。

目前临床上对心衰的诊断评估除了体格检查、多种辅助检测外，结合NT-proBNP、Hcy等生物活性指标来判断心衰病人疾病进展的方式受到研究人员的肯定。但NT-proBNP、Hcy等生物活性指标以蛋白质为基础，且其蛋白质成分比较复杂，具有多样性，故而在含量较低的样本中敏感性难以保证，诊断价值受限[7]。本研究结果显示，老年心衰病人血清中microRNA 499、Hcy、NT-proBNP表达水平明显高于健康对照组，提示老年心衰病人血清microRNA 499的表达水平明显升高，可作为心衰的辅助诊断指标。由于microRNA 499为心肌特异性microRNA，在心肌细胞缺血损伤时，细胞内的microRNA 499会过度释放至血液中[8]。另外，本研究还分析了老年心衰病人microRNA 499表达水平与NT-proBNP、Hcy水平的关系，结果发现，血清microRNA 499表达水平与Hcy、NT-proBNP水平均呈正相关，提示microRNA 499可能与Hcy、NT-proBNP指标一样，可作为心衰治疗及预后的辅助判断标志物。此外，ROC曲线结果显示：microRNA 499诊断老年心衰的ROC曲线的AUC为0.950，灵敏度为0.867，特异度为1，证明microRNA 499在心衰中的诊断价值较高，可以作为心衰的辅助诊断指标，可为心衰的诊断提供可靠参考。

综上所述，microRNA 499在老年心衰病人血清中的水平明显升高，与Hcy、NT-proBNP水平均呈正相关，在心衰中的诊断价值较可靠。