老年帕金森病与肠道菌群、短链脂肪酸和炎性因子相关性研究

李剑兰 余璇 胡青婷 左丹丹

PD是一种神经系统退行性疾病，与环境和遗传因素密切相关。研究表明，肠道菌群与中枢神经系统(central nervous system，CNS)之间存在相互作用[1-3]。肠道菌群有助于调节肠胃蠕动，促进营养吸收和代谢，调节黏膜免疫功能并维持肠道健康。胃肠道功能障碍在PD病人中早于运动症状的发生，被认为是PD的早期症状[4-5]。肠道菌群可能将肠道作为载体，将病变扩散至中枢神经系统，从而导致PD的发生发展[6]。此外，某些肠道产短链脂肪酸(Short-chain fatty acids，SCFAs)细菌丰度水平与PD之间密切相关，而SCFAs可调节肠神经系统(ENS)的活性，从而增加肠胃蠕动，改善PD的早期症状[7]。此外，SCFAs还具有调节免疫、改善炎性反应的作用[8]。PD与肠道菌群的相关性研究已有报道，但PD是否与SCFAs和炎症因子之间存在相关性鲜有报道。本文选取人肠道梭菌簇IV和梭菌簇XIVa两大优势菌群中产SCFAs细菌普拉梭菌(F.prausnitzii)和直肠真杆菌(E.rectale)，以及肠道益生菌双歧杆菌(Bifidobacterium)和乳酸菌(Lactobacillis)，分析肠道菌群、SCFAs和炎性因子与PD的关系，探讨PD发病及进展的可能机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2018年4月至2019年4月入住我院神经内科的PD病人，同时选取同一时间段我院年龄、性别与之相匹配的健康体检者作为对照组。PD组25例，男12例，女13例，年龄60～80岁，平均(68.34±6.15)岁。对照组25例，男15例，女10例，年龄60～80岁，平均(69.89±7.33)岁。纳入标准：(1)PD由专科医生进行确诊，严格按照帕金森病协会PD诊断标准[9]；(2)年龄≥60岁。排除标准：(1)近3个月内服用抗生素和微生态制剂；(2)近1年发生过非创伤性感染、过敏、免疫异常疾病；(3)有手术及其他应急情况人群；(4)排便习惯异常；(5)有明显肝、肾功能损害，慢性肠胃功能紊乱，有腹泻、胆道感染病史和肠炎等胃肠道疾病[10]。所有研究对象知情同意，并进行帕金森综合评分量表(Unified Parkinson’s Disease Rating Scale, UPDRS)评估。UPDRS包括精神、行为和情绪，日常活动，运动功能，治疗的并发症4个方面，分值越高，PD病人病情越严重。

1.2 仪器与试剂 实时荧光定量仪(Bio-rad IQ5，美国)，实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司，日本)，凝胶成像仪(Bio-rad，美国)，粪便细菌DNA提取试剂盒(凯杰，德国)，TNF-α、IL-6和IL-10试剂盒(上海钰博生物科技有限公司，货号：YBC102g；YBA079Ov01；YBA056Bo01)。所用引物如表1所示，所有引物由上海生工合成。

表1 16S rDNA基因实时荧光定量PCR定量肠道菌群引物

1.3 粪样采集及肠道菌群定量 收集2组研究人群早起空腹中段粪便，装入无菌的粪样收集管中，并标记日期、分组和姓名，置于液氮罐中后，装入-80 ℃冰箱保存。将收集的粪样进行16S rDNA基因实时荧光定量PCR定量检测，检测肠道菌群包括F.prausnitzii、E.rectale、Bifidobacterium、Lactobacillis，检测方法参照文献[10]。采用粪样细菌DNA提取试剂盒提取粪样细菌总DNA，吸取2μL作为扩增样本，分别加入各目标细菌引物进行PCR扩增，回收各细菌电泳条带作为阳性模板，采用绝对定量的实时荧光定量PCR法检测各目标肠道细菌的拷贝数，使用Log(copies)表示。

1.4 SCFAs测定 精密称取采集的早起空腹中段粪样0.3 g，进行预处理，配置乙酸、丙酸和正丁酸标准品，采用火焰离子化检测器，以氮气为载气，手动进样，每次进样量为1μL，运行18 min，通过与标准品保留时间对比定性，以峰面积定量计算粪样乙酸、丙酸和正丁酸水平，具体步骤参考文献[13]。

1.5 血样采集及炎性因子测定 收集2组研究对象早起空腹静脉血，离心后，严格按照TNF-α、IL-6和IL-10试剂盒说明书进行检测。

2 结果

2.1 2组UPDRS比较 与对照组相比，PD组病人UPDRS总得分明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2 2组肠道菌群比较 16S rDNA基因实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，PD组病人肠道E.rectale、F.prausnitzii和Lactobacillis水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；2组Bifidobacterium水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 2组人群UPDRS评分及肠道菌群比较

2.3 2组肠道SCFAs及血清炎症因子水平比较 与对照组相比，PD组病人肠道丙酸、丁酸水平明显降低，血清TNF-α、IL-6水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组人群肠道SCFAs和血清炎症指标比较

2.4 UPDRS与肠道菌群、SCFAs及血清炎性因子水平的相关性 Spearman相关性分析结果显示， UPDRS总得分与PD病人肠道E.rectale、F.prausnitzii、丙酸和丁酸水平呈负相关(P<0.05)，与血浆TNF-α和IL-6水平呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 UPDRS与肠道菌群、SCFAs及炎性因子的相关性(r)

3 讨论

PD是最常见的神经退行性疾病之一。ENS通过迷走神经与大脑双向通信，因此迷走神经是脑-肠轴的重要连接部分。肠道中微生物群组可以在脑-肠轴上发挥重要作用，通过影响ENS和CNS的神经元功能来发挥作用，成为胃肠道与CNS之间的双向交流系统。肠道菌群组和微生物代谢产物可参与新陈代谢并影响宿主健康，尤其在认知、行为和免疫方面。

研究表明，PD病人和健康对照者之间粪便微生物群的结构和丰度有所不同：与健康对照组相比，PD组粪样中布劳特氏菌(Blautia)、类杆菌(Faecalibacterium)和胃球菌(Ruminococcus)属水平显著降低；而肠贺氏菌(Escherichia-Shigella)、链球菌(Streptococcus)、变形杆菌(Proteus)和肠球菌(Enterococcus)属水平显著升高[14-15]。本研究发现，与对照组相比，PD组肠道F.prausnitzii水平明显降低，与文献报道一致;另还发现PD组人群肠道E.rectale、Lactobacillis水平明显降低。此外，本研究还发现UPDRS总得分与PD人群肠道E.rectale和F.prausnitzii水平呈负相关，从而验证了肠道菌群与PD之间存在相关性。F.prausnitzii和E.rectale属于产丁酸菌，是结肠中两大优势菌类，分别属于梭菌簇IV和梭菌簇XIVa。与对照组相比，PD病人肠道中产生抑制炎症丁酸盐的Blautia、粪球菌(Coprococcus)、罗氏菌(Roseburia)和Faecalibacterium属水平明显减少，而具有促进炎症的劳尔氏菌(Ralstonia)属水平明显升高[3]。肠道细菌可通过其合成神经递质和产生具有神经活性的代谢产物(如SCFAs)来调节免疫系统活化的能力，影响CNS[16]。PD除与某些肠道菌群丰度密切相关，还与粪便SCFAs水平减少密切相关。SCFAs的降低可能会引起ENS的改变，并导致PD病人的胃肠动力异常，加剧PD的病情进展[17]。本研究发现，与对照组相比，PD组病人肠道丙酸和丁酸水平显著降低。

SCFAs水平降低会损害肠道上皮屏障，从而使ENS更易受腔内病原体的侵害，导致炎症发生。SCFAs已被认为是肠道微生物群对肠道免疫功能影响的潜在介质。大量证据证实了神经炎症在PD病理中的作用，诸如小胶质细胞、星形胶质细胞、补体系统和细胞因子等炎性成分与CNS的神经炎症有关。研究表明，与对照组相比，PD组炎性细胞因子IL-6和TNF-α表达增加[18]，与本文研究结果一致。此外，本研究还发现UPDRS总得分与PD病人血浆TNF-α和IL-6水平呈正相关，说明TNF-α和IL-6可能参与PD的发生发展进程，但机制尚不明确，还需进一步研究。

综上所述，本研究推测PD病人出现胃肠道早期症状时，肠道菌群结构组成已发生变化，导致产SCFAs细菌水平降低，从而导致肠道SCFAs水平降低，增加体内炎症反应，并通过脑-肠轴影响CNS，加剧PD的发生发展进程。但该作用机制还需进一步进行研究验证。