一株致仔猪腹泻大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

于新友，李天芝

（山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

大肠杆菌是自然界中一种常见的革兰氏阴性菌，也是猪只肠道常在菌[1]，血清型众多，致病性大肠杆菌能够产生毒素及黏附因子，可引起猪多种疾病[2]。由产肠毒素性大肠杆菌引起的黄痢、白痢是一种仔猪常见腹泻性疾病[3]，临床表现为仔猪水样腹泻、消瘦、严重脱水等，发病急，死亡率高。大肠杆菌性腹泻在养猪场普遍存在，猪场一旦有发生就很难根除，发病猪即使有耐过，也会严重影响生长，饲料转化率降低，给养猪业造成严重经济损失[4]。由于抗生素在猪场的滥用，大肠杆菌耐药性显著增加[5]，常规药物治疗效果不理想，反而加重猪只各器官组织负担，加速死亡进程，因此，对临床分离菌进行药敏试验，筛选出最佳药物，以便采取针对性治疗措施，提升防控效果。

2020年9月山东滨州某规模化猪场，7日龄内仔猪发生腹泻，同窝仔猪发病率约为60%，病死率高达80%。同窝仔猪中先有个别仔猪发病，表现厌食、腹泻，后其他仔猪相继发生腹泻，排出黄色水样粪便，乳猪迅速消瘦、脱水、昏迷死亡。剖检可见胃内乳汁凝固不全，乳糜管内有脂肪。肠黏膜充血，肠壁水肿，肠内充盈液体和气体。经用青霉素、庆大霉素、红霉素药治疗但未见明显好转。临床采集发病猪肝脏、脾脏、肠道等组织送鲁北兽医诊断中心进行确诊。最终分离和鉴定了一株致病性大肠杆菌，并进行了药敏试验，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与试验动物

麦康凯琼脂购自青岛海博生物；革兰氏染色液草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、石炭酸复红染液等由山东绿都生物质量监察部提供；DL 2 000 Marker、rTaq购自宝生物工程（大连）有限公司。药敏纸片、糖发酵管及生化试验用各种试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司；猪流行性腹泻、传染性胃肠炎、轮状病毒三重荧光PCR检测试剂盒和猪德尔塔冠状病毒荧光PCR检测试剂盒均由山东绿都生物科技有限公司动物疫病检测事业部研制。致泄型大肠杆菌菌体抗原（O）诊断血清购自天津生物芯片生物技术有限责任公司。Axy Prep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。18～25 g清洁级昆明系小鼠10只，购自山东省实验动物中心。

1.2 引物

根据Gen Bank中登录的大肠杆菌16SrRNA基因序列，设计引物，上游引物：5′-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，下游引物：5′-CGTCATCCCCACCTTCCTC-3′，目的基因序列为1 091 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 腹泻性病毒RT-PCR检测

按照Axy Prep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒说明书操作提取样品中病原核酸，采用猪流行性腹泻、传染性胃肠炎、轮状病毒三重荧光PCR检测试剂盒和猪德尔塔冠状病毒荧光PCR检测试剂盒检测猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒。

1.4 细菌染色镜检与分离培养

用采集的发病猪肝脏、脾脏等病料样本触片、干燥固定，革兰氏染色、显微镜下观察。病料无菌条件下划线接种于麦康凯琼脂平板，37 ℃培养24 h，挑取红色中等大小光滑菌落接种于普通肉汤培养基中，置200 r/min摇床中37 ℃振摇培养18 h，取培养液0.1 mL涂布于麦康凯琼脂培养平板，染色、镜检。

1.5 生化试验

将分离菌纯培养液，接种于葡萄糖、乳糖等糖发酵管及其他生化管中进行生化试验，恒温箱中37 ℃培养24 h后观察结果。

1.6 PCR鉴定

取分离菌纯培养液200 µL，95 ℃恒温金属浴10 min，12 000 r/min离心2 min，取上清液做模板，进行PCR扩增反应。反应体系20 µL：PCR反应预混液rTaq 10 µL，上、下游引物各1 µL（15 pmol/L），模板1 µL，加纯化水补至20 µL。扩增反应程序：95 ℃3 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，35个循环。取PCR产物3 µL于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.7 药敏试验

取灭菌棉签，无菌操作蘸取分离菌纯培养液，均匀涂布于麦康凯琼脂平板上，置37 ℃培养箱数分钟直至琼脂表面无明显液体时贴药敏纸片。用无菌眼科镊子将药敏纸片轻轻紧贴于琼脂上，使得纸片按照梅花状分布，纸片间距离适当，置37 ℃培养16 h后观察结果，测量抑菌圈直径大小并记录数据。

1.8 抗原血清型鉴定

取分离菌纯培养液121 ℃下高压2 h，作为待检抗原。分别吸取待检抗原和大肠杆菌O抗血清各10 µL，在玻片上混合均匀，同时以生理盐水作阴性对照，观察并记录反应结果，2 min内出现明显凝集者判为阳性，否则为阴性。

1.9 动物致病性试验

取健康昆明系小鼠10只，随机分为两组，试验组和对照组各5只，取分离菌纯培养液腹腔注射试验组小鼠，0.2 mL/只，对照组注射生理盐水，同样0.2 mL/只，观察小鼠发病情况。

2 结果

2.1 腹泻性病毒RT-PCR检测

检测结果显示，病料中猪流行性腹泻、传染性胃肠炎、轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒核酸均为阴性。

2.2 细菌分离培养结果

组织触片染色镜检可见两端钝圆红色杆状细菌。麦康凯琼脂平板划线分离培养后，可见光滑、湿润、红色小菌落，直径2～3 mm。挑取单菌落，经涂片、革兰氏染色，干燥，镜检可见形态均一，两端钝圆、革兰氏阴性、中等大小的杆状细菌。

2.3 生化试验结果

该大肠杆菌分离株能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、木糖、鼠李糖、山梨醇，不能发酵卫矛醇、赤鲜醇、肌醇、菊糖，MR试验、吲哚、靛基质试验阳性，VP试验、硫化氢、构椽酸盐、尿素酶试验阴性，符合大肠杆菌的生化特征（表1）。

表1 分离菌的生化试验结果

2.4 PCR鉴定

琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR扩增产物大小为1 091 bp，符合预期结果。PCR产物测序结果显示与大肠杆菌16S rRNA基因的同源性为100%。

2.5 药物敏感性试验结果

药敏试验结果显示（表2），分离菌对头孢噻呋、恩诺沙星、复方新诺明、阿莫西林高度敏感，对青霉素G、氟苯尼考、四环素、红霉素、庆大霉素、阿米卡星等表现不同程度耐药。

表2 分离菌株的药物敏感性试验结果 mm

2.6 血清型鉴定结果

血清分型试验结果显示，所分离大肠杆菌O抗原血清型为O149。

2.7 动物致病性试验

昆明小鼠腹腔接种纯培养分离菌液5 h后开始出现精神委靡、食欲不振，同时伴有站立不稳、共济失调等神经症状，最终死亡，48 h内小鼠全部死亡。剖检可见肝、脾肿大和肺出血，肠管肿胀、出血，肠内充满黄色液体。无菌采集肝脏接种麦康凯琼脂平板，过夜培养后，挑单菌落，革兰氏染色镜检，可见革兰氏阴性小杆菌。对照组小鼠健活，剖杀后无菌采集肝脏进行细菌分离，结果未分离到细菌。

3 讨论

猪腹泻性疾病是危害养猪业发展的最重要的一类疾病，引起猪腹泻原因包括细菌性、病毒性、寄生虫性，以及环境、营养因素等。猪发生腹泻后一定要查找原因，尽快确诊，从而采取相应措施，不能凭主观判断随意治疗，延误病情，可能会造成大损失。随着全面禁抗时代的来临，猪场细菌病发生有抬头趋势，猪场一定要重视细菌病防控，本案例猪场发生腹泻初次抗生素治疗不见效果后，怀疑为病毒感染所导致腹泻，错过疾病治疗时机，猪场造成一定损失。后经实验室诊断排除了一些常见的病毒性疾病（猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒病和德尔塔冠状病毒病），进一步细菌分离鉴定后确诊大肠杆菌为引起猪腹泻的病原。因此，猪场遇到类似问题时，应及早送相关实验室进行诊断排查，确定病因后才针对性的采取治疗措施。

大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为O抗原、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），其中根据O抗原对大肠杆菌进行血清型分型，至今已发现170多种血清型。本试验结果显示，所感染大肠杆菌血清型为O149，与国内相关文献报道的不同地区分离的猪源性大肠杆菌的血清型有一定的差异性。要选取未经抗生素治疗的猪只，无菌采集相应组织器官，进行细菌分离，病料保证新鲜，低温保存运输。药敏试验结果表明，本病例所分离大肠杆菌对猪场常用抗生素青霉素G、氟苯尼考、四环素、红霉素、庆大霉素、阿米卡星表现出不同程度耐药，分析原因可能为猪场长期不规范、不科学的抗生素使用促使细菌在药物压力下产生耐药质粒所致，或所感染菌本身为耐药菌，今后猪场在防控猪病时，一定要进行药敏试验，选取敏感药物，轮换或穿梭用药，防治超级耐药菌产生，提升猪场疫病防控效果，同时改善猪场环境，加强饲养管理，做好常规疫苗接种工作，减少腹泻疾病发生概率，提升猪场养殖效益。

导致腹泻的大肠杆菌血清型众多，各血清型间交叉保护性差。不同地区所流行大肠杆菌血清型不同，即使在同一地区不同养殖场的大肠杆菌血清型也不同[6]，因此，研究当地或某场大肠杆菌流行血清型和耐药性，对大肠杆菌病的防控具有重要意义。可以筛选分离本地区优势血清型菌株制备自家苗。本研究对某规模化猪场病死猪解剖，分离鉴定了致腹泻O149的大肠杆菌血清型，为自家灭活疫苗研制奠定了基础。