实用免疫组化组织微阵列对照体系的构建及其蜡块、切片的制作方法
2021-04-10孙雯雯吴开祥李小龙东野圣伊丁宝琪杨洪川王新立
孙雯雯 吴开祥 李小龙 张 亚 东野圣伊 黄 虎 丁宝琪 杨洪川 王新立
山东第一医科大学第二附属医院病理科,山东 泰安 271000
免疫组化检测技术在临床病理诊断工作中发挥着至关重要的作用。免疫组化染色技术因其步骤复杂,影响因素较多,在免疫组化染色过程中设立对照成为免疫组化染色质控的重要措施[1-4]。随着免疫组化技术的不断发展,免疫组化对照的设立涌现出不同的方法。很多方法步骤繁琐,需要特殊仪器设备支持,实用性不高。本科室根据实际临床工作经验,在遵循国际特殊专家委员会建议及免疫组织化学检测技术共识的基础上构建了免疫组化组织微阵列对照体系,并用简易方法制作蜡块及切片,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 组织来源
山东第一医科大学第二附属医院临床病理外检中满足临床病理诊断后剩余的常规新鲜组织。
1.2 仪器设备
Leica ASP 300自动脱水机、Leica RM2235石蜡切片机、Leica 819一次性病理刀片、Leica EG1150H石蜡包埋机及冷台、不锈钢包埋模具、世泰粘附性载玻片。
1.3 组织微阵列体系的构建
根据本实验室抗体使用频率、所需对照组织获取的难易度、抗体在不同组织中表达情况,遵循国际特设专家委员会推荐18种常见抗体对照组织、免疫组织化学检测技术共识及染色结果判断标准的基础上,构建组织微阵列体系,满足每种抗体在检测时具有至少一个的阳性对照,一个阴性对照,并尽可能提供多个阳性、阴性对照组织。
1.4 目的组织筛选
所需组织用10%中性缓冲福尔马林固定24~48 h,按常规取材标准取材,全自动脱水机常规进行脱水、透明、浸蜡,包埋成蜡块。将蜡块行HE切片并染色,根据镜下观察选定组织的目的区域,并作标记。目的区域的选择应首先满足无钙化无坏死无异物(如缝合用钢钉)区,其次要保证抗体表达的阳性部位存在,如阑尾要有淋巴滤泡及腺体结构,甲状腺要有正常腺体,结肠、胃等要保证有肠粘膜、胃粘膜,所选肿瘤组织如乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌等镜下确保是肿瘤组织。
1.5 组织微阵列蜡块的制作
用废旧一次性病理刀片,将组织目的区域切成约0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm的小组织块,按照组织微阵列对照体系分组,用尺寸较小的包埋磨具(约0.7 cm×0.7 cm)将目的组织包埋,制成组织微阵列蜡块并标记编号。包埋时要注意组织方向,如阑尾、结肠、食管等管腔类组织纵切面朝下,并确保全部组织埋平。
1.6 组织微阵列切片的制作
组织微阵列蜡块冷冻后进行切片,切片厚度2.0~2.5 μm,蜡片贴裱于免疫组化专用粘附性载玻片据底端0.5 cm处中央,用铅笔标记阳性对照组织微阵列的编号,72 ℃烤片15~30 min,或室温自然凉片至干燥。室温保存备用,随切随用,对照片满足1周使用即可,防止时间过长引起抗原丢失。组织微阵列蜡块每次切完后放置于-20 ℃冰箱内冷藏,随用随切,还可保护组织内抗原,防止其丢失。
2 结 果
2.1 构建了5个组织微阵列对照体系,编号为1~5。1号包括阑尾、肺、肝癌、胰腺、扁桃体;2号包括子宫内膜及肌层、乳腺癌、宫颈癌、食管、结肠;3号包括网膜、甲状腺、胎盘、肾、胃;4号包括GIST、腱鞘巨、前列腺癌、P53、睾丸;5号包括表达(0,1+,2+,3+)her-2的乳腺癌组织。5个组织微阵列,分别用于不同抗体的对照使用,可为我科室130多种抗体提供稳定可靠的阳、阴性组织对照。具体见表1。
表1 组织微阵列对照体系构成
2.2 制作了5种组织微阵列蜡块,无需特殊仪器设备,技术易掌握(图1)。
2.3 制作了5种组织微阵列切片,方法简单,组织贴裱于载玻片据底端0.5 cm处中央,被测试组织贴裱其上方即可,整齐美观(图1)。
a:组织微阵列蜡块;b:检测组织与微阵列对照组织染色切片;c:组织微阵列免疫组化染色后镜下表现。
3 讨 论
免疫组化染色步骤繁多,任何一步操作不当都可能会影响染色结果,进而影响病理诊断的准确性。在免疫组化染色过程中设立对照是进行染色质量控制的重要措施之一,通过阳性对照、阴性对照的染色结果可验证免疫组化操作步骤是否正确、染色结果是否准确及染色试剂是否有效,从而确保免疫组化染色技术最佳化和结果的有效性。理想状况的对照是将一个已知的抗原表达情况的组织和待检测样本置于同一张切片上进行染色,确保所有试剂同时与待检测样本和对照组织反应,最大限度地保证二者检测条件的一致性[5-8]。免疫组化染色结果的判读包括两个方面,即定性分析和定量分析,因此设置的阳性对照不仅要满足验证目的抗原的存在与否,而且不同的阳性对照组织要反应出抗原表达水平的弱强。设置阳性对照还应该遵循适用免疫组化染色的检测下限(lowlimitofdetection,LLOD)原则,即在已知的低表达某一抗原蛋白的组织或细胞成分中能观察到阳性反应[9-10]。
单一组织做阳性对照,不仅不能满足免疫组化阳性、阴性对照等上述要求,而且实际工作中三甲医院病理科应用抗体数量一般达百余种,每种抗体设立阳性对照,需要的阳性对照蜡块必定很多,切好备用的对照片种类及数量相应更多,实际应用中易造成工作程序复杂,桌面混乱不整洁,对照片使用错误等情况。因此利用组织微阵列做免疫组化染色对照成为免疫组化质量控制的利器。本组织微阵列体系的构建是根据实际临床工作经验,在遵循国际特殊专家委员会建议、免疫组织化学检测技术共识的基础上,由多年免疫组化操作经验技师与具有免疫组化诊断经验的高年资病理诊断医师共同构建的,5个组织微阵列可满足我科室130多种抗体的免疫组化染色中对照使用。1号组织微阵列覆盖的抗体范围达60余种,主要用于标记淋巴瘤,肺癌、神经内分泌肿瘤的鉴别诊断抗体;2号组织微阵列为诊断上皮来源肿瘤、乳腺癌、宫颈癌的抗体对照;3号组织微阵列提供了来源间皮、甲状腺、肾脏、胎盘、胃等部位的抗体对照;4号组织微阵列提供了腱鞘巨细胞肿瘤、间质瘤、前列腺及睾丸肿瘤的鉴别诊断抗体对照;5号微阵列专门针对乳腺癌、胃癌等染Her-2提供对照[11-12]。组织微阵列构成可根据科室自身情况灵活调整,尤其是科内罕见病的特殊对照,如:标记恶性黑色素瘤melanA,标记基因异位型肾细胞癌的TFE-3等需要专门留取。
传统组织微阵列蜡块的制作需要组织芯片仪等仪器设备,过程繁琐,对技师技能和石蜡品质要求较高,因打孔位置不准确、凝蜡程度把握不到位等,易出现石蜡碎裂、组织塌陷或切片时组织蹦飞等情况[13-14],实际操作困难。本组织微阵列蜡块制作方法优点颇多:技术方面,操作简单,无需制备空白蜡块、无需打孔、定位、注芯等精确度高、难度系数较大的操作,每个微阵列组织数量约4~5个,所需组织来源广泛,包埋时保证埋平即可,不额外增加制作难度;病理诊断安全方面,选取的对照组织是满足临床病理诊断需求剩余的组织,而不是在原病理诊断的蜡块上钻取组织,不仅保护了病理诊断的原始蜡块,还使得病理标本发挥更多有益作用;在经济方面,利用废旧的一次性病理刀片切割组织,不需要购买组织芯片仪、组织芯片穿刺针等仪器设备,也无需购置价格昂贵的高纯度切片石蜡,不增加科室额外支出。
该组织微阵列总面积约0.5 cm×0.5 cm,占用玻片面积小,不妨碍待测试组织裱贴,适用于手工染色及自动染色机染色。组织微阵列贴裱于载玻片距底端0.5 cm处,不会造成因测试组织位置过高而引起的试剂浪费,如leica bond max自动染色机,还可防止其covertile边框把玻片边缘的组织抹掉,保证了对照组织在染色过程中的完整性。被测试组织均位于对照微阵列的同一个方向,可方便诊断医师阅片,且整齐美观。
简言之,本组织微阵列对照方法科学合理,既保留了组织微阵列体积小、通量高、灵活性强、检测试剂与实验条件一致性、实验误差小等优点[15-16],还具备经济节约、操作简单、实用性强的特点。不仅满足免疫组化染色质控要求,而且操作简单,经济实用,大大提高工作效率,符合免疫组化染色标准,值得在实际临床免疫组化染色工作中推广。