泰安地区儿童流感嗜血杆菌感染耐药性分析*

高 雪 吴玲玲 伦恒忠

泰安市中心医院检验科,山东 泰安 271000

流感嗜血杆菌俗称流感杆菌，是一种常见的革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，常寄居在人上呼吸道，当机体免疫力低下时可引起呼吸道感染。流感嗜血杆菌是儿童呼吸道感染的重要病原菌之一，严重者可引起儿童肺炎、脑膜炎等。近年来，随着流感嗜血杆菌对β-内酰胺酶类抗生素的敏感性降低以及多耐药菌株的出现，临床对该病的治疗难度明显增加。本研究以近1年来我院收治的呼吸道感染患儿为研究对象，探究流感嗜血杆菌的流行趋势及耐药情况，以了解流感嗜血杆菌流行趋势及耐药状况，为本地区儿童流感嗜血杆菌感染的治疗提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2019年1月—2019年12月期间，我院住院儿科患者自痰、支气管灌洗液、咽拭子等标本分离到的188株临床样本，剔除同一患者同次住院、相同部位分离的菌株。

1.2 标本采集

所有患儿均于抗生素应用前留取痰液、气管灌洗液、咽拭子等标本。标本合格判定标准：痰液：低倍镜下观察每视野鳞状上皮细胞<10个；气管灌洗液：镜检鳞状上皮细胞<1%总细胞数；所有标本留取后均在2 h以内送检。

1.3 主要试剂及仪器

万古霉素巧克力平板、流感嗜血杆菌药敏实验专用培养基购自郑州安图生物科技股份有限公司；V因子、X因子、药敏纸片、头孢硝噻吩纸片购自英国OXOID；细菌鉴定仪ATB Expression及革兰氏阴性菌API-NH鉴定卡购自法国梅里埃。

1.4 菌落鉴定

将标本接种于含有万古霉素的巧克力平板上，置于35 ℃、5%CO2培养箱培养18～24 h，孵育完成后挑取无色或灰白色、透明或半透明的单个微小菌落，在血琼脂平板上进行卫星试验并行革兰氏染色镜检，结果符合者最后在ATB Expression细菌仪鉴定。

1.5 药物敏感实验

挑取单个流感嗜血杆菌菌落，配成浓度为0.5 MCF单位的菌悬液，用无菌棉签均匀涂抹在流感嗜血杆菌药敏实验专用培养基上，用K-B法进行检测，结果参照2016年美国临床实验室标准化委员会的标准判断。

1.6 β-内酰胺酶检测

采用头孢硝噻吩纸片法，室温平衡纸片后，无菌去离子水浸湿纸片，用无菌环刮取少量流感嗜血杆菌菌落涂抹在纸片表面，观察纸片颜色，变红为阳性，否则为阴性。

1.7 质控菌株

流感嗜血杆菌ATCC49247; 金黄色葡萄球菌ATCC29213；粪肠球菌ATCC29212。

1.8 统计学方法

药敏实验采用软件WHONET5.6进行数据处理和分析，统计学结果采用SPSS 19.0软件进行分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 标本分布

188株流感嗜血杆菌，其中154株来源于痰液，24株来源于咽拭子，7株来源于气管灌洗液，3株来源于鼻腔分泌物。见表1。

表1 流感嗜血杆菌分离标本分布

2.2 性别及年龄构成

188例儿科病患中，男性患儿119例，占63.3%；女性患儿69例，占36.7%。年龄构成：小于1岁婴幼儿88例，占46.8%；1～5岁患儿77例，占40.9%；6～14岁儿童23例，占12.3%；统计发现，5岁以下儿童占有显著比例，见表2。

表2 流感嗜血杆菌感染患儿年龄分布

2.3 β-内酰胺酶耐药

188株流感嗜血杆菌中，有156株产β-内酰胺酶，产酶率为83.5%。

2.4 药物敏感实验

188株流感嗜血杆菌对氨苄西林、复方新诺明敏感性均小于30%；头孢噻肟、亚胺培南、美洛培南、环丙沙星、左旋氧氟沙星以及阿奇霉素敏感性均为100%，对头孢呋辛、四环素、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、氯霉素耐药范围为3.2%～41.5%，见表3。

表3 流感嗜血杆菌耐药

3 讨 论

流感嗜血杆菌是一种条件致病菌，各年龄阶段的人群均可感染，老年人和儿童是易感人群。近年来，研究显示儿童可占该菌全部感染人群的48.13%之多[1]，是儿童呼吸道感染的重要致病菌之一。

流感嗜血杆菌可引起儿童中耳炎、鼻-鼻窦炎、腺样体肥大等，严重者可引起肺炎、脑膜炎。流感嗜血杆菌通过黏附侵入呼吸道上皮细胞、外膜蛋白改变等机制逃脱机体吞噬，长期在人呼吸道定植，最终导致感染发生。

本研究中，流感嗜血杆菌主要分离自呼吸道分泌物，其中痰最多，占82.1%，其次为咽拭子，占12.7%，支气管肺泡灌洗液占3.7%，此外,鼻咽分泌物占1.5%。本研究中所分离流感嗜血杆菌感染患者中，男性患儿(63.3%)所占比例高于女性(36.7%)，提示男性儿童可能更容易受该菌感染，与国内他人研究趋势基本一致[2]。另外，患儿的年龄构成比例中，婴幼儿及学龄前儿童所占比例较大，结果显示，≤5岁患儿占87.7%，较>5岁儿童对流感嗜血杆菌易感，结果具有统计学意义，与他人报道的以3岁以下儿童为主稍有不同，考虑与地域及流行菌株不同有关[3]，说明本地区5岁以下婴幼儿是流感嗜血杆菌感染的高危人群，分析其原因和幼儿鼻腔中无鼻毛、鼻粘膜柔弱易受到感染，气管与支气管的管腔相对狭窄，黏液分泌少以及纤毛运动性差等因素有关。

由于近年来抗菌药物的广泛使用及环境变换等诸多因素，流感嗜血杆菌的耐药性呈上升趋势。本研究发现β-内酰胺酶产生率为83.5%，高于本地区2016—2017年朱刚等人[4]产酶率51.84%～57.61%的报道，分析除了耐药率有所上升以外，也和分离病菌感染人群不同有关。本研究发现，耐药情况最严重的抗生素为氨苄西林，耐药率为83.5%；其中β-内酰胺酶产生率和氨苄西林耐药率相符，未发现β-内酰胺酶阴性的氨苄西林耐药菌株，提示氨苄西林耐药全部是因为耐药菌株产生β-内酰胺酶所致。常见的β-内酰胺酶包括TEM-1和ROB-1L两种，大多数菌株产生的酶以TEM-1为主，该机制由质粒介导，部分为质粒接合子，并携带完整的TnA型转座子及其他耐药基因；而产β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药菌株常常考虑是细菌细胞壁上青霉素结合蛋白改变所致，青霉素结合蛋白活性位点发生改变后，与药物的亲和力减弱，从而导致耐药发生；另外，β-内酰胺酶阴性耐药菌株也与细菌外膜蛋白改变有关[5]；本研究结果提示，氨苄西林已不适为治疗流感嗜血杆菌感染的首选抗生素。另外，复方新诺明的耐药率为75.5%，说明磺胺类药物亦已不宜作为流感嗜血杆菌感染的治疗药物，该药物的耐药可能是过度产生双清叶酸还原酶，导致细菌对甲氧苄啶亲和力发生改变所致[6]。本实验研究氨苄西林及复方新诺明耐药率比2018年CHINET中国细菌耐药性监测报告(氨苄西林耐药率：57.2%，复方新诺明耐药率：61.6%)有所升高。另外，细菌的生物膜耐药也是值得关注的耐药机制之一[7]。

不同研究显示，各地关于流感嗜血杆菌耐药情况不尽相同。杭州地区儿童流感嗜血杆菌近年对氨苄西林和复方磺胺甲恶唑的耐药率分别为29.64%和43.57%，对阿奇霉素和亚胺培南的耐药较低，分别为0.36%和0.71%[8]。 北京地区儿童350株流感嗜血杆菌对甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药率最高，为76.9%；其次是氨苄西林为52.0%；对β-内酰胺酶以外抗菌药物，最敏感的是环丙沙星，耐药率为0.9%，其次为氯霉素，耐药率为1.1%[9]。太原地区自儿童呼吸道分离1 316株流感嗜血杆菌，其中有733株产β-内酰胺酶(产酶率为55.7%)；产β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药菌株为89株,占6.8%；甲氧苄啶-磺胺甲恶唑的耐药率最高,为67.0%；其次为氨苄西林,耐药率为62.5%；对头孢呋辛的耐药率为32.3%；对阿莫西林/克拉维酸、阿奇霉素的非敏感率分别为7.2%、28.8%[10]。郑州地区儿童感染流感嗜血杆菌对氨苄西林、复方新诺明以及头孢唑林的耐药性均达到70%以上,对左氧氟沙星、美罗培南、亚胺培南以及阿莫西林/克拉维酸的耐药性最低[11]。西南成都地区流感嗜血杆菌对氨苄西林、头孢克洛、头孢呋辛的耐药率均高于50%，且总体呈上升趋势；而对头孢噻肟、利福平、氧氟沙星的耐药率均小于6%[12]。

本研究中，所分离188株流感嗜血杆菌对头孢噻肟、亚胺培南、美洛培南、环丙沙星、左旋氧氟沙星以及阿奇霉素敏感性均为100%。但在临床使用中，亚胺培南通常用于临床重症感染，而环丙沙星及左氧沙星由于关节毒性等影响儿童身心发育，亦不能作为常规一线药物使用，因此考虑将头孢噻肟、美罗培南、阿奇霉素作为儿童流感嗜血杆菌感染的常规使用药物。

综上所述，流感嗜血杆菌是引起儿童呼吸道感染的重要致病菌，其对常用抗生素敏感性差异较大，工作中应注意检测流感嗜血杆菌的耐药性变化，为临床抗菌药物的合理使用提供保障与依据。