玉露花茎诱导的2种愈伤组织细胞学及分化研究

张青华 王微 陈鹏 谢文申 张应华

(1 云南农业大学园林园艺学院 云南昆明 650201;2 北京擎科生物科技有限公司昆明分公司 云南昆明 650051;3 云南农业大学香料中心 云南昆明 650201;4 云南农业大学云南省滇台特色农业产业化工程研究中心 云南昆明 650201)

玉露（Haworthia cooperi）为百合科十二卷属多年生肉质草本植物，是软叶品种，原产于南非，现世界多地均有栽植，因其透亮如露珠的外形而深受欢迎，市场需求较大［1-2］。玉露传统的繁殖方法主要有分株、叶插、茎插、播种［1］等。传统繁殖方法存在繁殖周期长、效率低的问题。近年来组织培养因其繁殖速度快、成苗量大而逐渐成为玉露种苗生产的一种重要方法。现阶段对玉露组织培养的研究主要集中在外植体的选用、快繁建立、增殖、生根阶段激素的配比等方面，如外植体主要用花茎和叶片，激素主要用生长素（NAA、IAA、IBA AC）和细胞分裂素（KT、6-BA）搭配［3-5］。以上相关研究促进了玉露组培技术的发展，但是还存在诸多问题，一些品种存在快繁的瓶颈问题，如繁殖率低、玻璃化和褐化等，至今仍然没有得到很好的解决［5］。为解决这一系列问题，了解植株再生过程中愈伤组织的分化情况很有必要。愈伤组织器官形成方式有不定芽发生和胚状体发生两种，离体培养中植株以体细胞胚的方式再生在园艺植物中较为常见［6］，植物体细胞胚再生方式具有普遍发生、遗传稳定、适于作为外源基因转化受体系统等优点［7］。目前，对玉露愈伤组织的研究较少，严小峰等［8］对诱导玉露胚性愈伤组织的激素配比进行研究，但判定胚性愈伤组织仅凭眼睛观察；朱洁琼等［9］对冰灯玉露的体细胞胚形态学、解剖学进行研究，但是没有愈伤组织分化过程的形态学、细胞学研究。本研究对玉露体细胞诱导的愈伤组织以及愈伤组织的分化做了形态学，细胞学方面的探讨，以期明确玉露愈伤组织分化的途径及不同分化途径的区别，为优化十二卷属观赏植物离体快繁技术体系以及新品种创造提供一定的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材

玉露花茎来源于温室栽培。

1.1.2 试剂

蒸馏水，75% 酒精，0.1% HgCl2，10% NaClO，MS 培养基，NAA，6-BA，蔗糖，谷氨酰胺，水解酪蛋白，碘化钾，玻片等。

1.2 方法

1.2.1 试验体系的建立

1.2.1.1 材料处理

于2017 年3 月中旬取温室栽培的玉露花茎，长10～20 cm，在自来水下冲洗，除去花茎表面灰尘、花粉等杂物；冲洗好后剪成合适长度，用蒸馏水浸泡搅拌2 min；将处理好的花茎放入75%的酒精中消毒30 s，接着用0.1% HgCl2消毒5 min，10%NaClO 消毒4 min。以上每项处理之后，均用无菌水冲洗5次。

1.2.1.2 愈伤组织诱导

将灭菌后的每个花茎用吸水纸吸干表面水分，然后剪成1～1.5 cm 的茎段，将其接种在MS+0.2 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+3%蔗糖、pH 5.8 的固体培养基上进行暗培养，培养温度为21～23℃。

1.2.1.3 继代培养

将获得的愈伤组织进行继代培养，培养基配方为MS+0.2 mg/L NAA +1.5 mg/L 6-BA+3%蔗糖+100 mg/L 谷氨酰胺+250 mg/L 水解酪蛋白。转接愈伤组织时，去掉外植体，小心地将愈伤组织成块转接。培养温度21～23℃，光照强度为2 200 lx，12 h/d，培养25 d 之后继续继代，直至愈伤组织分化。

1.2.2 玉露胚性愈伤组织细胞学的鉴定

1.2.2.1 1%碘化钾溶液的配制

称取8 g 碘化钾溶于100 mL 蒸馏水中，待全部溶解后，加入1 g 的碘，振荡，完全溶解后保存在棕色瓶内。

1.2.2.2 淀粉染色观察

用洁净纱布将载玻片和盖玻片擦拭干净，然后在载玻片中央滴一滴清水，用单面刀片切取一小块愈伤组织，完全浸入水滴，将愈伤组织展平，盖上盖玻片，避免出现气泡；在盖玻片一侧滴一滴1%碘化钾溶液，用吸水纸从另一端吸引，使染液完全浸润标本；静置染色10～15 min 后用显微镜进行观察记录，拍照。

1.2.2.3 石蜡切片制作

石蜡切片采用常规的石蜡切片方法，采用铁矾—苏木精染色法。

2 结果与分析

2.1 玉露花茎诱导的愈伤组织继代培养

玉露花茎外植体接种在培养基上10～15 d 后，上部分幼嫩位置的花茎开始膨大，初步诱导出紧密、淡绿色、质地较硬的块状愈伤组织（图1-a）；经过2次继代培养后，愈伤组织增殖并且形态发生改变，继续培养，逐渐出现2种不同形态的愈伤组织，一种是松脆颗粒状愈伤组织（图1-b），另一种是结构较为松散，外表粗糙的愈伤组织（图1-c）。

图1 玉露花茎诱导出的愈伤组织

2.2 两种愈伤组织外部形态鉴定结果

对2 种不同的愈伤组织进行外部形态学观察。观察结果显示：A类愈伤组织外表呈颗粒状（图1-b），颜色为淡黄绿色，外表光滑，质地较硬；B 类愈伤组织外表呈团状（图1-c），颜色为黄白色，外表粗糙，质地绵软。

2.3 两种愈伤组织细胞观察结果

对2种愈伤组织做细胞观察。淀粉染色结果观察发现，A 类愈伤组织染色的细胞较多，染色较深，单个细胞可观察到明显的淀粉颗粒（图2-a）。B 类愈伤组织不能染色或仅在细胞周边染色，难以观察到明显的淀粉颗粒（图2-e）。石蜡切片观察结果显示，A 类愈伤组织可观察到细胞较小、染色较深、细胞核明显、排列整齐的细胞群（图2-b、2-c）；有细胞核的单个细胞细胞核和核仁较大，细胞质染色明显，说明胞质浓厚（图2-d）。B类愈伤组织愈伤组织细胞大小不均匀，细胞排列松散且细胞形状不规则，细胞核不明显（图2-f、2-g）；有细胞核的单个细胞中，细胞质未被染色，且细胞核较小（图2-h）。初步判断A类愈伤组织中细胞较小、染色较深、核仁较大、胞质浓厚的细胞群为胚性细胞。

2.4 两种愈伤组织分化情况的细胞学观察

将A、B两类愈伤组织继续继代培养，A类愈伤组织保持颗粒状增殖并开始分化，B 类愈伤组织增殖为块状、水渍状愈伤组织，并逐步开始分化。A类和B 类愈伤组织的分化途径明显不同。A 类愈伤组织分化时在愈伤组织表面出现绿色半透明突起（图3-a），从中能观察到分化出的球形胚（图3-b）、子叶形胚（图3-c、3-d）；切片观察显示，绿色半透明突起为多个分化的胚性细胞团（图3-e），正在分裂的胚性细胞团周围的细胞为非胚性细胞，说明每一个分化的胚性细胞团相对独立（图2-b）；在分化的细胞团中能观察到胚芽和胚柄（图3-f），说明体细胞胚分化的双极性；观察到分化出的芽体型较小，形态较为完整（图3-g）；继续培养，成苗速度较快，再生苗变异小（图3-h）。B类愈伤组织分化初期为绿色不规则突起，这些突起继续分化形成单极器官芽，经继续培养后以产生不定芽的方式继续分化（图3-i）；切片能观察到不定芽的细胞分化，与胚性细胞相比，这些细胞保持较大和较为松散的形态进行分裂、分化（图3-j），同时还观察到几个不定芽连在一起分化的情况（图3-k）；分化出的不定芽形态不完整，大小差异大，继续培养可以成苗（图3-l）；后期培养发现成苗的速度慢，变异较为明显。

2.5 两种愈伤组织的判断

图2 两种愈伤组织细胞观察结果

根据Zimmerman 的体细胞胚发生理论［6］，体细胞胚发生于胚性细胞，其过程不产生与母体组织相联系的维管组织，与植物合子胚的发育过程类似，具有两极性的发生形式。在甘蔗、棉花等作物的胚性愈伤组织均发现有松脆颗粒状结构、生长比较缓慢或排列较松散且易碎的外部形态学特征，胚性细胞具有细胞较小，细胞质的多胺、可溶性糖、淀粉含量较高，具有较大的细胞核和核仁，染色较深，呈圆形，细胞排列有序等特点［10-12］。胚性愈伤组织分化时，有成苗量大、速度快、芽结构完整的特点［12］。根据对玉露诱导的两种愈伤组织细胞的观察结果，以及愈伤组织分化的形态学和细胞学观察结果，推测A类愈伤组织为体细胞诱导的胚性愈伤组织，这种愈伤组织的植株再生方式为体细胞胚胎发育方式，分化过程类似于合子胚的发育方式，再生植株来自于胚性愈伤组织中胚性细胞的分裂和分化。B 类愈伤组织为非胚性愈伤组织，再生植株来源于继代培养后有分化能力的非胚性细胞分化的不定芽。胚性愈伤组织发生的再生植株较多，体型较小，每个芽彼此分离，眼睛可见有叶和茎部较为完整的植株器官，继续培养生长较快，能有效避免玉露组织培养易变异的问题，并且保持较高的成苗率。非胚性愈伤组织通过不定芽的方式产生再生植株，植株往往最先分化出单极器官芽，分化时会出现几个芽连在一起分化的情况，继续培养能够成为再生植株，但生长分化速度慢，芽变异较为明显。

图3 两种愈伤组织的分化观察

3 讨论与结论

观赏型植物胚性愈伤组织可通过不同的外植体诱导得到，如种子（多花蔷薇）［13］、叶柄（百合）［14］、花丝（白姜花）［15］，下胚轴、子叶、茎段（白刺花）［16］。本研究使用玉露花茎为外植体，经过脱分化诱导出胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，经观察发现胚性愈伤组织细胞核大、细胞质浓密、排列紧密；非胚性愈伤组织细胞呈不规则排列，分布较松散，细胞间隙较大，为无明显细胞核结构的细长或大的高度液泡化的大型薄壁细胞团，这与朱洁琼等［9］以冰灯玉露叶片为外植体诱导的愈伤组织结果一致，说明玉露外植体脱分化产生的愈伤组织中同时存在胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，其中胚性愈伤组织发生较为普遍。在胚性愈伤组织的分化过程中，观察到了球形胚、子叶形胚，说明胚性愈伤组织的分化是按照体细胞胚胎的发育过程进行的，这样可确保再生植株的遗传稳定性。在植物生长调节剂使用上，本研究使用NAA 和6-BA，严小峰等［8］使用6-BA 和2，4-D，朱洁琼等［9］使用6-BA 和IAA，多种生长素类物质均能诱导玉露产生胚性愈伤组织。

体细胞胚胎的再生方式相对于器官发生具有再生率高、速度快、数量多等优点，是观赏植物大规模繁殖的一种重要方式。本研究将玉露花茎诱导的愈伤组织进行继代培养，对继代及分化过程中出现的2种愈伤组织外形和细胞进行观察，发现一种为胚性愈伤组织，另一种为非性愈伤组织。胚性愈伤组织以体细胞胚胎发育方式进行分化，能观察到球形胚、子叶形胚的发育阶段，符合单子叶植物合子胚发育过程；继续培养后发现此方式分化的无菌苗变异小、生长快。非胚性愈伤组织以器官发生方式进行分化，大部分是先形成芽，再形成完整植株，分化过程慢，易变异。虽然玉露胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织均能分化出再生植株，但通过胚状体途径分化可以有效地解决组培苗变异大、玻璃化、生长缓慢等问题。本研究结果可优化十二卷属观赏植物离体快繁技术体系，进一步为新品种创造提供一定的技术支撑。