TNFR2与三氯乙烯致敏小鼠免疫性肝损伤的关系研究

杨 呓，徐琼影，黄 猛，姜 伟，丁百旺，张家祥，朱启星,2

三氯乙烯(TCE)是一种无色且容易挥发的有机溶剂，工业上被广泛用作去污剂和萃取剂等。TCE可通过呼吸道、皮肤以及消化系统进入人体，造成与药物过敏反应相似的皮肤损伤，中国将其定义为“职业性三氯乙烯药疹样皮炎”(occupational medicamentosalike dermatitis due to TCE，OMLDT)。OMLDT 患者出现皮疹的同时常伴不同程度的肝脏损害，严重者可很快发展为急性肝衰竭，目前普遍认为Ⅳ型变态反应并不能完全解释TCE所致的多重脏器损伤，人群研究表明OMLDT 患者血清细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α水平显著高于正常人群组。TNF-α是一种多向性细胞因子，主要通过结合TNFR1和TNFR2两种受体发挥重要的免疫调节作用。前期研究表明，在TCE致敏小鼠中，肝脏TNF-α表达水平有升高现象。TNFR1几乎在所有类型的细胞上都可以表达，主要介导细胞毒性作用；而 TNFR2 则特异性地表达于免疫和内皮细胞上，主要发挥介导T 细胞增殖和调控细胞信号传递的作用。近年来有实验表明，在胆道闭锁小鼠肝脏中TNFR2在多个时段表达升高，而阻断TNFR2后肝脏损伤减轻。TNFR2在OMLDT患者肝脏损伤中的表达与作用尚不明确，因此，该研究建立了TCE致敏小鼠模型，通过验证小鼠肝脏内TNF-α表达情况以及全方面检测TNFR2表达水平，对TNFR2与OMLDT引发的肝脏损伤的关系做了探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

购入21只6～8周龄SPF级小鼠，雌性，品系为BALB/c，选自安徽医科大学实验动物中心，体质量(21.36±1.28)g。将小鼠饲养在干净清洁的隔离笼中，保持适宜的温度(20～25 ℃)和湿度(50%±5%)，并使用12 h光照和12 h黑暗交替饲养，提供标准的饲料和洁净饮水。实验方案和动物使用规章经安徽医科大学生物医学伦理委员会批准。该研究中使用随机化原则将小鼠分为3组：空白对照组5只，溶剂对照组(橄榄油加丙酮)5只和TCE处理组11只。

1.2 试剂与仪器

TCE、橄榄油、丙酮(上海化学试剂公司)；弗氏完全佐剂(FCA)(美国Sigma公司)；免疫组化检测试剂盒、DAB 显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；肝功能ALT、AST检测试剂盒、RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术公司)；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、TNFR2抗体(ab109322)、TNF-α抗体(ab1793)(英国Abcam公司)；PVDF膜、ECL发光液(美国Advansta公司)；苏木精与伊红染色液(南京建成科技公司)；全自动生化分析仪(美国Bio-Tek公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)；LightCycler96实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)。

1.3 动物模型与实验分组设计

参照课题组前期的实验，建立TCE经皮致敏小鼠模型。第1天，对TCE处理组小鼠的背部皮下注射50 μl、50% TCE(TCE ∶橄榄油 ∶丙酮=5 ∶2 ∶3，50 μl)和50 μl、FCA混合物进行首次刺激。第4、7、10天，对小鼠背部剃毛预处理并均匀涂抹100 μl、50%TCE进行致敏。在第17天和第19天，使用100 μl、30% TCE(TCE ∶橄榄油 ∶丙酮=3 ∶2 ∶5，100 μl)涂抹，对小鼠背部皮肤进行激发。空白对照组不接受任何处理，溶剂组涂抹100 μl丙酮与橄榄油混合溶液(橄榄油 ∶丙酮=2 ∶3，100 μl)作为对照，两组实验流程安排与TCE处理组相同。在末次激发24 h后，对小鼠背部的皮肤反应评分：0分无反应；1分皮肤散在轻度变红；2分中度和弥漫性变红；3分皮肤高度的红斑和肿胀。小鼠评分≥1分，则判断为TCE致敏并归类为致敏组(阳性组)，否则为未致敏组(阴性组)。在末次激发72 h使用颈椎脱臼法处死小鼠，无菌操作取小鼠血液、肝脏和其他组织样品备用。

1.4 肝功能测定

眼静脉丛收集小鼠血液，4 ℃离心机以3 000 r /min 离心15 min吸取上清液血清。按照肝功能试剂盒说明书在96孔板进行血清ALT和AST检测，调整酶标仪至510 nm波长，测定每孔OD值，代入标准方程计算血清中ALT和AST的活性。

1.5 肝脏病理学染色

将新鲜小鼠肝脏浸泡于多聚甲醛中，在摇床上放置48 h后石蜡包埋，制作石蜡切片，用二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水、用PBS洗涤切片3次，先用苏木精染色3 min，流动纯水冲洗3 min，再用伊红染色15～20 s，清洗3 min后用60 ℃烤箱烘片4 h，用中性树脂封片，显微镜下观察组织的病理损伤情况。

1.6 免疫组织化学(IHC)检测

将肝脏切片用二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水，接着用PBS清洗3次，用内源性过氧化物酶封闭，放入柠檬酸钠缓冲液用微波进行抗原修复，自然冷却至室温后滴加山羊血清封闭，37 ℃室温封闭20 min，分别滴加TNFR2和TNF-α抗体放入4 ℃ 冰箱孵育过夜。第2天提前拿出玻片在室内复温，再依次滴加生物素标记的二抗和辣根酶，用DAB显色后冲洗玻片，苏木精复染细胞核，烤箱烘干后在显微镜下拍摄，图片使用Image pro plus软件进行免疫组化评分。

1.7 实时荧光定量PCR检测小鼠TNFR2的mRNA

取大约50～100 mg肝脏进行组织抽提，在匀浆器中加入1 ml、TRIzol低温抽打匀浆，室温裂解10 min，加入氯仿后振荡30 s，离心后加入异丙醇，提取肝脏组织总RNA，利用逆转录酶合成cDNA后，在每孔加入MIX 10 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，DEPC水7 μl，cDNA 1 μl，进行PCR程序扩增，检测目的基因表达。扩增程序为90 ℃、10 s，60 ℃、15 s，72 ℃、20 s，共循环45次。用GAPDH 作为内参基因，2(Livak)法计算TNFR2的mRNA的相对表达量。GAPDH上游引物序列为5′-ACCCCAGCA AGGACACTGAGCAAG-3′，下游引物序列为5′-GGCCCCTCCTGTTATTATGGGGGT-3′；TNFR2上游引物序列为5′-TGGGTCTGCTGATGTTAGG-3′，下游引物序列为5′-GACCTGCTCATCCTTTGG-3′。

1.8 Western blot检测TNFR2蛋白表达水平

用RIPA组织裂解液与PMSF蛋白酶抑制剂处理肝脏组织，提出蛋白后用BCA试剂盒测定蛋白浓度，每孔上样5 μl，用SDS-PAGE进行电泳分离，200 mA转膜3 h，用脱脂牛奶室温封闭2 h，用TNFR2一抗封闭过夜(1 ∶10 000)，第2天用PBST和PBS清洗条带4次后，室温孵育山羊抗兔IgG(1 ∶2 500)二抗2 h，再次用PBST和PBS洗涤条带后，使用ECL检测试剂盒中按照1 ∶1配置的ECL发光液进行显影，得到图片经灰度值处理分析后，将TNFR2条带与内参蛋白 GAPDH 比较，判断各组蛋白表达水平。

2 结果

2.1 小鼠皮肤致敏情况

根据皮肤反应评分，第20天将小鼠分为致敏组和未致敏组，空白对照组和溶剂对照组小鼠背部皮肤表现正常、无明显皮损，TCE处理组小鼠皮肤出现不同程度的红肿，计算TCE组致敏率(背部皮肤红肿数/各组小鼠总数)，致敏率为45.45%(5/11)。见表1。

表1 小鼠皮肤致敏评分和致敏率

2.2 肝功能检测结果

与空白对照组比较，溶剂对照组小鼠血清中的ALT与AST测定结果差异较小，差异无统计学意义。与空白对照组和溶剂对照组比较，TCE未致敏组测定结果无明显改变，差异无统计学意义。TCE致敏组ALT与AST水平分别为(144.18±24.28)U/L和(71.91±8.29)U/L，与空白对照组、溶剂对照组和TCE未致敏组比较均有增高趋势，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见图1。

图1 小鼠血清ALT与AST水平与空白对照组比较：*P<0.05；与溶剂对照组比较：#P<0.05；与 TCE未致敏组比较：△P<0.05

2.3 肝脏病理学染色结果

观察HE染色的肝组织学切片。空白对照组和溶剂对照组及TCE未致敏组的肝脏组织肝细胞排列整齐，大小正常，染色均匀，形态学无明显改变。TCE致敏组肝细胞出现大量空泡呈蜂窝状，部分细胞形态异常，胞质疏松，糖原颗粒减少，如图2所示，黑箭头处显示细胞排列紊乱，出现空泡样变性，有炎性细胞浸润。

图2 小鼠肝脏的HE病理染色结果 ×400A：空白对照组；B：溶剂对照组；C：TCE 未致敏组；D：TCE 致敏组

2.4 肝脏组织中TNF-α表达结果

免疫组化结果显示，TNF-α在空白对照组和溶剂对照组之间表达水平较低，在TCE未致敏组仅可见少量表达，而在TCE致敏组中阳性染色区域明显，与其他3组比较，TNF-α表达量升高，且差异有统计学意义(

P

<0.05)。见图3和表2。

图3 小鼠肝脏TNF-α表达结果 ×400A：空白对照组；B：溶剂对照组；C：TCE 未致敏组；D：TCE 致敏组

2.5 肝脏组织中 TNFR2表达结果

空白对照组和溶剂对照组背景干净，无显著阳性表达，TNFR2表达水平较低；TCE未致敏组仅可见少量散在TNFR2蛋白沉积；而TCE致敏组TNFR2表达较高，与其他组比较，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见图4和表2。

图4 小鼠肝脏TNFR2表达结果 ×400A：空白对照组；B：溶剂对照组；C：TCE 未致敏组；D：TCE 致敏组

表2 小鼠肝脏TNF-α和TNFR2免疫组化评分

2.6 小鼠肝脏TNFR2的mRNA表达水平

与空白对照组比较，溶剂对照组中的TCE未致敏组TNFR2的mRNA表达水平均未见明显升高，差异无统计学意义；而在TCE致敏组中，TNFR2的mRNA表达水平较其他3组显著升高，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见图5。

图5 小鼠肝脏 TNFR2 mRNA表达水平与空白对照组比较：*P<0.05；与溶剂对照组比较：#P<0.05；与 TCE未致敏组比较：△P<0.05

2.7 Western blot法检测小鼠肝脏TNFR2蛋白表达水平

与空白对照组比较，溶剂对照组和TCE未致敏组的TNFR2蛋白表达量均无明显改变，差异无统计学意义；在TCE致敏组中，TNFR2的蛋白表达含量较其他3组升高，差异有统计学意义(

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<0.05)。见图6。

图6 Western blot法测定小鼠肝脏TNFR2蛋白表达结果与空白对照组比较：*P<0.05；与溶剂对照组比较：#P<0.05；与 TCE未致敏组比较：△P<0.05

3 讨论

TCE是一种用途广泛的有机溶剂，在工业使用过程中可通过呼吸道吸入和皮肤接触进入人体。目前由TCE接触导致的OMLDT已成为全国严重职业危害之一，且其发病有由沿海向内陆逐渐扩展的态势。由于该病缺乏早期诊断指标，发病后尚未发现特效治疗药物和方法，因此病程较长，TCE可造成多重脏器损伤，而肝功能衰竭是其致死的主要原因之一。目前学者普遍认为的Ⅳ型变态反应并不能完全解释TCE所致的多重脏器损伤，人群研究表明OMLDT 患者血清细胞因子TNF-α水平高于正常人群组，而课题组近几年研究也表明，TCE致敏小鼠肝脏内TNF-α表达水平升高。TNF-α是一个多功能的细胞因子，参与多种细胞活动，包括诱导炎症因子产生，细胞增殖、分化和凋亡。该实验建立了TCE经皮致敏小鼠模型，在TCE致敏阳性组中，小鼠出现了不同程度的肝损伤，相比空白对照组、溶剂对照组及TCE未致敏组小鼠，TCE致敏组小鼠血清ALT、AST活力升高，差异有统计学意义(

P

<0.05)。肝脏病理结果显示TCE致敏组肝细胞发生空泡样变性，细胞核破裂，胞质流失并有部分炎性细胞聚集。此外，免疫组化实验表明TCE致敏小鼠肝脏中TNF-α表达含量较其他组确有上升，差异有统计学意义(

P

<0.05)。TNF-α主要通过与两种类型的跨膜受体的结合而实现其功能，它们就是TNFR1和TNFR2。TNFR1的胞内段有特征性的死亡结构域，主要介导经典的促炎、细胞毒性和细胞凋亡等功能。相比之下，TNFR2则缺乏该类死亡结构域，并且表达更加局限，主要表达于免疫细胞、内皮细胞和某些神经元细胞上，主要功能是介导与细胞活化和增殖相关的信号通路，在调节性T细胞(Tregs )和髓源性抑制细胞(MDSCs )的增殖和功能中起着重要作用。Tregs是一群典型的免疫抑制性T细胞，能终止过度的自身免疫反应，维持免疫稳态，而其数量和功能的失衡可能导致多种免疫性疾病。课题组近年的研究表明：TCE的免疫毒性能够改变小鼠免疫脏器中Tregs细胞的数量比例，引起小鼠体内Tregs细胞失衡。而有研究表明，TNF-α对Tregs数量及功能的影响是通过TNFR2实现的，阻断TNF-α/TNFR2 信号轴后会导致肿瘤微环境中Tregs减少。此外，TNFR2参与了多种肝脏疾病的发生发展，在胆道闭锁小鼠模型中，TNFR2表达显著升高，肝脏组织汇管区出现炎性细胞浸润，而阻断TNFR2 信号后，下游NF-κB和MAPK-STAT3表达显著减少，小鼠表型减轻，生存率提高。Siegmund et al研究表明TNFR2打开了一种依赖于RIPK1激酶活性的促炎信号传导模式，随后可上调Traf1、IL-6和IL-1β等细胞因子。在一些肿瘤与免疫性疾病中，使用TNFR2拮抗剂或激动剂可提高治疗效果，TNFR2是扩展功能性Tregs来治疗自身免疫性疾病的新兴靶标。该实验检测了TNFR2在肝脏中的表达，免疫组化结果表明在TCE致敏组中TNFR2大量沉积，且空白对照组、溶剂对照组中的TCE未致敏组未见明显表达。同时Western blot与QRt-PCR实验结果也表明 TCE 致敏组小鼠TNFR2的蛋白水平和mRNA水平较空白对照组、溶剂对照组和TCE未致敏组有升高现象，差异有统计学意义(

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<0.05)。实验结果表明在TCE诱导的肝脏损伤过程中TNFR2表达增加，而针对这一现象，使用拮抗剂或激动剂靶向作用于TNFR2可能作为一种治疗免疫相关疾病和癌症的新策略。