卡托普利抑制糖尿病视网膜病变大鼠脂代谢紊乱的作用及机制

高 翔，刘 扣，桂衍超，陈可洋，蒋正轩

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见、也是最严重的微血管并发症之一，其机制可能与血脂代谢异常有关。总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)的浓度变化可视为脂质代谢紊乱的指标之一。Mahmoudabady et al的报道指出，降低TC、TG浓度是治疗DR的有效手段。卡托普利作为血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)，其在治疗DR上具有重要意义，但机制尚不清楚。最新研究表明卡托普利能够降低大鼠血清TC、TG浓度。由此推测，卡托普利改善大鼠DR可能与其降低视网膜中TC、TG浓度有关。胆固醇调节元件结合蛋白质转录因子(sterol regulatory element binding protein，SREBP)是脂质稳态的主要调控因子。其中，SREBP1是脂肪酸合成的特异性限速酶，它的活性及表达对TG的合成和分泌具有显著的影响；而SREBP2是胆固醇合成的特异性限速酶，直接参与细胞内胆固醇代谢的调控。

该研究采用卡托普利治疗2型糖尿病视网膜病变大鼠，通过检测血清TC、TG浓度的变化，观察大鼠视网膜病理学改变，并进一步检测视网膜中SREBP1、SREBP2表达水平的变化来探讨其作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

卡托普利、HE染色试剂盒(北京索莱宝公司)；血糖仪、血糖试纸(美国罗氏公司)；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、小鼠抗β-actin(美国Sigma 公司)；一抗：兔Anti-SREBP1抗体、兔Anti-SREBP2(美国abcam公司)；山羊抗兔 IgG 抗体、山羊抗小鼠 IgG抗体(北京中杉金桥生物有限公司)；凝胶扫描成像系统Fine-do X6显影仪(上海天能科技有限公司)；BCA蛋白浓度测试试剂盒(上海碧云天公司)，TG、TC检测试剂盒(南京建城生物工程研究所)；其余常见试剂和耗材均来自安徽医科大学卫生检验与检疫学系教研室。

1.2 实验动物及干预

选取SPF级8周龄雄性SD大鼠30只，体质量均为180～200 g(安徽医科大学实验动物中心)。实验前适应性饲养1周，所有动物均自由进食，大鼠生活环境为 12 h白/12 h黑暗的昼夜节律，动物房温度为(23±2) ℃，相对湿度为(50±5) %。随机选取10只大鼠作为正常对照组给予普通饲料喂养；20只大鼠作为造模组先给予高脂饲料喂养4周，之后每周1次给予禁食不禁水喂养16 h后，将大鼠称重并按35 mg/kg于左下腹注射配置好的STZ溶液(STZ溶于1%的枸橼酸-枸橼酸三钠溶液配成0.1 mol/L，pH值4.3的缓冲液)，注射72 h后测空腹血糖≥11.1 mmol/L确定为糖尿病模型；测空腹血糖<11.1 mmol/L大鼠继续高脂饲料喂养1周，重复该步骤，共3周全部造模成功。将成模的大鼠随机分为卡托普利干预组(DM+CAP)和0.9%氯化钠溶液对照组(DM+NS)，每组各10只。DM+CAP组大鼠给予卡托普利溶液每天25 mg/kg灌胃，DM+NS与正常对照组则给予等量的0.9%氯化钠溶液灌胃。每周1次检测大鼠体质量、空腹血糖(禁食8 h)。大鼠垫料每天更换2次，保证其生活条件干燥舒适。灌胃操作共持续8周。

1.3 实验动物干预后处理

药物灌胃8周后，对每只大鼠进行安乐死，立即打开胸腔，抽取腹主动脉血，用0.9%氯化钠溶液经心脏灌洗直至脏器变苍白，摘取双眼眼球。一侧眼球置于多聚甲醛组织固定液中待用，另一侧眼球立刻磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，移至解剖显微镜下，在角巩膜缘下2 mm处沿赤道方向剪开，去除眼前节和玻璃体，钝性分离视网膜，储存在1.5 ml EP管中，液氮冷冻，于-80 ℃保存。该研究经安徽医科大学动物伦理委员会批准，按照安徽医科大学动物实验规范进行。

1.4 血清TC、TG浓度及视网膜病理学检测

待收集的全血凝固后，在4 ℃、3 000 r/min条件下离心15 min，取上层血清，检测TC、TG浓度(mmol/L)。大鼠眼球固定72 h后，将眼球清洗、乙醇脱水、石蜡包埋，并沿视神经走向切片，HE染色。

1.5 视网膜SREBP1、SREBP2蛋白水平检测

称取20 mg视网膜组织，经裂解匀浆后取上清液，BCA法进行蛋白定量，变性后于-20 ℃保存，SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白，PVDF纤维素膜转膜，一抗(Anti-SREBP1、Anti-SREBP2)室温孵育1 h或4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育30～60 min。孵育好的PVDF膜清洗后滴加配置完成的显影液，置于显影仪中进行显影并记录保存。对显影结果进行灰度扫描，对灰度值进行统计分析。

2 结果

2.1 大鼠体质量、空腹血糖的变化

DM+CAP组及DM+NS组大鼠均表现出多饮多食多尿的糖尿病特征，而正常对照组无上述特征。糖尿病模型组与正常对照组比较，体质量均下降，差异有统计学意义(

P

<0.01)。DM+CAP组与DM+NS组体质量见图1A。DM+CAP组、DM+NS组大鼠血糖一直保持在20 mmol/L以上。见图1B。

图1 大鼠体质量及空腹血糖A：大鼠体质量变化趋势图; B：大鼠空腹血糖变化趋势图; 与正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.2 视网膜组织形态学变化

DM+NS组大鼠视网膜的组织形态较正常对照组大鼠视网膜组织发生明显的改变。HE染色显示，正常对照组大鼠的视网膜组织结构规则，各层分界清楚；DM+NS组大鼠视网膜组织结构紊乱(黄箭)，分界不清，神经纤维层有大量新生血管生成(黑箭)；DM+CAP组大鼠视网膜组织结构稍显疏松，但各层界限较清晰，少有新生血管分布。见图2。

图2 视网膜组织病理学观察 HE×200A：正常对照组大鼠视网膜结构；B：DM+NS组大鼠视网膜结构；C：DM+CAP组大鼠视网膜结构

2.3 卡托普利降低糖尿病大鼠血脂相关指标

检测大鼠血清中TC浓度，正常对照组为(4.03±0.40)mmol/L，DM+NS组为(20.20±2.38)mmol/L，DM+CAP组为(8.11±0.74)mmol/L，3组相比，差异有统计学意义(

F

=199.522，

P

<0.01)。见图3A。检测大鼠血清中TG浓度，正常对照组为(2.08±0.50)mmol/L，DM+NS组为(21.41±1.56)mmol/L，DM+CAP组为(13.54±1.61)mmol/L，3组相比，差异有统计学意义(

F

=321.64，

P

<0.01)。见图3B。与正常对照组比较，DM+NS组血清TC、TG上升，卡托普利的干预降低了该数值。

图3 大鼠血清中TC、TG含量A：大鼠血清中TC的含量；B：大鼠血清中TG的含量；1：正常对照组；2：DM+NS组；3：DM+CAP组； 与正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与DM+NS组比较：#P<0.05

2.4 卡托普利对视网膜SREBP1、SREBP2的影响

Western blot重复检测蛋白，结果显示：与正常对照组比较，DM+NS组、DM+CAP组大鼠视网膜SREBP1蛋白水平升高，差异有统计学意义(

P

<0.05)；DM+NS组大鼠视网膜中SREBP2升高，差异有统计学意义(

P

<0.05)，但DM+CAP组与正常对照组间无统计学意义。与DM+NS组比较，DM+CAP组大鼠视网膜SREBP1、SREBP2均降低，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见图4A、B。由此可见，卡托普利不仅降低了TC、TG在血清中的含量，在视网膜组织中同样下调了TC、TG调控因子SREPB2、SREBP1的表达水平。

图4 视网膜SREBP1、SREBP2蛋白水平A：SREBP1/β-actin；B：SREBP2/β-actin；1：正常对照组；2：DM+NS组；3：DM+CAP组；与正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与DM+NS组比较：#P<0.05

3 讨论

该实验中，卡托普利降低了DM血清TC、TG浓度。此外，SREBP1、SREBP2在DM视网膜中表达上调，而卡托普利的治疗抑制了两种蛋白的表达。这些结果表明，卡托普利通过下调视网膜中SREBP1、SREBP2的表达水平降低视网膜血供中TC、TG的浓度。与正常对照组比较，DM视网膜组织形态恶化，而卡托普利治疗组的大鼠视网膜形态有明显改善。该实验表明，卡托普利在DR中通过调节脂代谢异常发挥保护作用。

DR的基本病理特征是新生血管的生成。Sun et al指出，新生血管的生成与脂代谢失衡有关，研究者在脂代谢紊乱的小鼠眼睛中发现视网膜新生血管及视网膜神经节病变，并指出该机制可能与脂肪酸代谢失调有关。研究表明，SREBP1作为脂肪酸合成的限速酶，对TG合成具有重要意义，抑制SREBP1的表达能有效降低TG的合成和分泌。SREBP2 作为胆固醇合成的特异性限速酶，通过与HMG-CoA 还原酶和LDL受体等基因上的SRE区域发生特异结合，直接参与细胞内胆固醇代谢的调控，从而影响机体的脂质代谢过程。在该实验采用卡托普利治疗DR大鼠，通过检测大鼠血清TG、TC浓度验证既往结论，通过病理组织切片观察卡托普利对DR大鼠的治疗效果，并进一步检测了大鼠视网膜中SREBP1、SREBP2的蛋白表达，探索卡托普利治疗DR的分子机制。临床研究表明，强化降血脂治疗延缓了DR患者的病情进展，但是强化降血压治疗没有延缓DR的进展，说明血压波动对DR进展无明显影响。该实验中，卡托普利具有降血压作用，但该作用与该实验结果无明确相关性，因此没有检测大鼠血压变化。

该实验采用的方法是目前应用最广泛的HFD/STZ诱导法，此方法操作简单、易于成模，且制备糖尿病模型稳定，接近人2型糖尿病。研究表明，采用高脂饲养联合STZ诱导的糖尿病大鼠模型长期稳定，并且大鼠糖尿病眼病随着糖尿病病程不断发展而进展，与临床糖尿病眼病的相关病理改变极为相似，是研究糖尿病眼病较为理想的动物模型。

综上所述，该研究表明卡托普利通过调节SREBP1、SREBP2降低TC、TG水平，抑制新生血管，是卡托普利保护DR的新作用机制。该实验实验样本量较少，仍需进一步扩大样本量进行研究。