钛种植体载银对牙龈卟啉单胞菌抗菌效应研究

吴雨峰，王 刚，李 思，程佳蕙，吴明月

钛基金属因具有优良的生物相容性，在口腔种植领域得到了广泛的应用，但其本身并不具备抗菌性能，种植术后感染及种植体周围炎的发生成为现阶段临床需要解决的难题之一。因此，改善钛种植体表面的抗菌性能成为国内外学者研究的热点。近年来，构建含纳米结构的钛种植体表面并搭载抗菌药物引起了广泛关注。钛基材表面原位构建的二氧化钛纳米管(TiOnanotubes，TNT)结构，因其较大的比表面积且单端封闭，与钛基底结合稳固，可作为搭载药物的良好载体。而以银为代表的无机抗菌剂，因具有有效浓度低、抗菌谱广且不易产生耐药菌的优点，成为抗菌领域研究的热点材料。基于此，该实验通过阳极氧化法在钛基材表面构建TNT结构，再采用层层自组装技术在其表面制备含纳米银粒子的聚电解质多层膜(polyelectrolyte multilayer membrane，PEM)结构，通过体外抑菌试验检测样品对牙龈卟啉单胞菌(

porphyromonas

gingivalis

，Pg)的抗菌效应，为种植体表面抑菌涂层研究提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

钛片(北京中金研新材料科技有限公司)；硝酸银(合肥诺一生物科技有限公司)；氟化铵(广州西陇化工股份有限公司)；壳聚糖、肝素、赖氨酸(合肥苗茁生物科技有限公司)；Pg国标菌株ATCC33277(广东微生物保存中心)； 其余一般试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，且试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

LP6003D型直流稳压电源(深圳市乐达精密工具有限公司)；Sirion-200场发射扫描电镜(美国FEI公司)；X射线光子能谱仪(XPS,美国Thermo-VG Scientific公司)；接触角测量仪(成德成慧实验机器有限公司)；UV-1800紫外-可见光分光光度计(日本岛津公司)。

1.3 实验过程

1.3.1

TNT的制备 将纯度99.99%、厚度0.25 mm钛箔片加工成直径15 mm圆形钛片，经400、600、800、1 000目金刚砂纸打磨光滑，依次放入盛有丙酮、75%无水乙醇、去离子水的玻璃器皿中，超声清洗各20 min。干燥后放入浓度为0.3 mol/L氟化铵电解质溶液(丙三醇与双蒸水体积比为1 ∶1)中，钛片接阳极，石墨接阴极，采用直流稳定电压20 V，反应时间3 h，进行电化学阳极氧化，反应结束后将样品取出、清洗、置于恒温干燥箱中干燥备用。

1.3.2

纳米银粒子的制备 将1 ml 乙酸溶于99 ml蒸馏水中，搅拌混匀制成乙酸水溶液。将0.5 g的壳聚糖缓慢溶于乙酸水溶液中，配成5 g/L的壳聚糖/乙酸水溶液，搅拌30 min。分别将5.09、8.94、16.98 mg的硝酸银粉末加入上述浓度的壳聚糖/乙酸水溶液中，搅拌混匀，使硝酸银的浓度分别为0.3、0.5、1 mmol/L，然后将壳聚糖/硝酸银水溶液放入恒温箱里，95 ℃加热12 h、冷却、静置备用。称0.5 g肝素钠置于100 ml双蒸水中，制成5 g/L的肝素钠溶液。

1.3.3

载银纳米管的制备 将前述阳极氧化法制备的钛片样品分成3组，置于2.5 g/L多聚赖氨酸溶液内浸泡30 min，作为启动基础。再将样品置于肝素溶液内10 min，去离子水轻轻冲洗、N干燥，再分别置于不同浓度的壳聚糖/硝酸银中10 min，去离子水冲洗、干燥，完成第一次聚电解质膜的制备。接下来交替、反复在这两种聚阳、阴离子中浸泡，每次沉积壳聚糖和肝素的时间均为10 min，如此循环操作多次，最终获得理想的多层聚电解质复合物多层膜，并且最外一层为壳聚糖。该实验进行上述循环10次。

1.3.4

实验分组 该实验分为6组：空白组；纯钛组(Ti组)；TNT组；0.3 mmol/L硝酸银组(Ti-PEM组)；0.5 mmol/L硝酸银组(Ti-PEM组)；1.0 mmol/L硝酸银组(Ti-PEM组)。

1.3.5

样品表征检测 该实验选取Ti组、TNT组和Ti-PEM组为检测对象。场发射扫描电镜观察样品表面形貌；接触角测试分析材料表面亲水性；XPS测定样品表面成分；ICP-AES检测样品银离子释放速率。

1.3.6

样品抗菌效果及对生物膜影响 该实验采用Pg为实验用菌，将保存于-80 ℃环境下标准菌株解冻复苏后，接种于由脑心浸液琼脂制备出的血琼脂培养皿中，37 ℃厌氧箱中培育48 h，传代、稀释、培育后，选出菌落分布均匀、易于计数的浓度菌液作为试验菌源，该试验选取浓度值为10CFU/ml菌液作为试验用菌。将前述制备的样品灭菌处理后置于12孔板中，每孔加入菌液500 μl，37 ℃厌氧环境下培养48 h，轻振使样品上黏附细菌脱落，然后从每孔中吸取适量菌液稀释至适宜浓度，接种于新的血培养皿中，6 h后平板计数法计算活菌数，通过计数结果计算各样品抗菌率。另取样品置于12孔板中，每孔加入菌液500 μl，37 ℃厌氧环境下培养48 h，弃去培养基，无菌PBS缓冲液轻柔冲洗孔板，洗去浮游菌群，避免破坏形成的生物膜，每孔加入200 μl结晶紫溶液，染色10 mim，双蒸水冲洗至水流无色，室温下风干，每孔添加至200 μl醋酸溶液，室温放置10 min，每孔吸取150 μl溶液至96孔板中，使用酶标仪测量600 nm下吸光度值，计算生物膜形成量。

2 结果

2.1 钛基材表面形貌特征

扫描电镜显示：光滑钛表面呈镜面状；TNT表面呈均匀分布的蜂窝状结构，管腔平均直径约70 nm；层层自组装加载10层聚电解质多层膜后，纳米管状结构消失，表面平滑光整，并可见由于膜层不均匀形成的斑状结构。断面结构显示TNT高度均一，约700 nm。见图1、2。

图1 光滑钛片及TNT表面微观结构 ×30 000A：光滑钛片组；B：TNT组；C：Ti-PEM组

图2 光滑钛片及TNT表面微观结构A：光滑肽片组×30 000；B：TNT×50 000

2.2 材料表面亲水性分析

如图3及表1所示，纯钛组接触角接近90度，显示出疏水的性能；相较于纯钛组，TNT组材料表面接触角显著下降，呈现出较好的亲水性；加载多层膜后，亲水性较TNT组有所下降，但较纯钛组仍改善明显。差异均有统计学意义(

F

=154.34,

P

<0.05),LSD-

t

检验结果表明各组之间两两比较差异均有统计学意义(

P

<0.001)。

表1 样品表面接触角角度

图3 接触角测量图片A：光滑钛片组； B：TNT；C：Ti-PEM组

2.3 X射线光电子能谱分析

图4A、B分别为TNT加载PEM前后的XPS谱图，结果显示PEM修饰后样品Ti峰值强度减弱，且出现Ag峰，提示该实验利用LBL技术成功在钛基材表面构建载银PEM。

图4 XPS分析图谱A：TNT；B：Ti-PEM组

2.4 银释放量分析

由释放曲线可见：银的释放速率随着时间的延长逐渐减慢，最初的24 h内银释放速率较快，而后释放速率减慢并保持稳定，直至第6天仍维持释放。见图5。

图5 不同浓度下Ti-PEM的银释放曲线

2.5 材料抗菌效果及其对生物膜的影响

由图6、7可以看出，经载银PEM修饰过的钛片对Pg的抗菌性能较纯钛组和TNT组得到了显著提升，均达到90%以上，表明载银涂层对于Pg具有较强的抗菌作用。如图8所示，结晶紫染色结果显示，3组载银钛基材表面检测到的成熟生物膜的总量较纯钛组和TNT组有明显减少，提示材料表面载银可以有效减缓Pg生物膜的形成，差异有统计学意义(

P

<0.05)。

图6 各样本表面细菌培养计数结果A：空白组；B：Ti组；C：TNT组；D：Ti-PEM0.3组；E：Ti-PEM0.5组；F：Ti-PEM1.0组

图7 各样品对Pg抗菌率与Ti组比较：*P<0.05

图8 各样品表面生物膜形成总量与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

牙种植体植入人体后，由于手术带来的创伤和其所在的复杂微生态环境，口腔丰富的菌群不断迁移至种植体周围，可能引发种植体周围炎，影响种植治疗的成功率。目前，提高种植体抗菌性能的研究主要有两种方法：一是通过物理化学方法在种植体表面制备抗菌表面，直接减少细菌的黏附，达到抗菌目的；二是采用共价接枝、层层自组装等技术在种植体表面构建抗菌涂层，通过抗菌物质的释放实现抗菌功能。在众多研究方法中，制备多层膜装载无机抗菌剂，构建的种植体表面抗菌涂层，表现出有效浓度低、抗菌谱广、不易产生耐药性等优点而备受关注。因此，该实验选取银为抗菌剂，以TNT为基材，采用层层自组装的方式将银装载于纳米管表面，构建种植体表面抗菌涂层，并通过与Pg共培养考察其抗菌效果，以期实现改善钛种植体表面抗菌性能的目的。

纳米银作为该实验选用的无机抗菌剂，与传统抗生素相比，具有令人满意的抗菌性能、抗菌谱广且生理环境下不易产生耐药菌株等优点，Li et al研究显示，纳米银粒子(silver nanoparticles，AgNP)在低浓度(0.5 mmol/L)时，对牙周组织细胞的黏附、增殖及形态变化无明显抑制作用。该实验参考Wei et al的方法，壳聚糖作为还原剂和稳定剂，水热法制备AgNP，参考0.5 mmol/L的细胞毒性界限设置不同的浓度梯度，并以壳聚糖/银溶液作为聚阳离子电解质，与天然负电荷高分子聚合物肝素通过正负电荷吸引，形成较强的聚电解质多层膜结构，有望得到结构稳定、生物相容性佳的种植体表面涂层。XPS检测结果显示，经自组装多层膜修饰后的样品Ti峰值减弱，同时在368.3 eV和374.3 eV检测到两个特征峰，查询XPS手册可得此双峰为零价态银，由此表明该实验制备出的银元素为单质银。提示该实验可能成功加载载银PEM于钛基材表面。

近年来，钛基材表面纳米化修饰以改善其抗菌性能和生物相容性，成为该方面研究的重要方法。研究表明通过阳极氧化法在种植体表面制备出的粗糙、致密结构，能够在负载银、锌等金属离子提供良好抗菌作用，同时，促进成骨细胞的黏附，提高其活性和功能表达，在骨结合的过程中起到一定的协同作用。据此，该实验采用电化学阳极氧化法在钛基材表面构建TNT阵列。扫描电镜结果显示出特有的蜂窝管状结构，课题组近几年研究表明该直径下TNT载药效果佳且药物缓释效果最优。通过ICP-AES结果分析可知，最初24 h Ag释放速率较快，可能与钛基材所加载的PEM最外层是壳聚糖/纳米银涂层有关，随着时间的延长，PEM不断降解，Ag的释放速率减慢并逐渐趋于稳定，实验结果显示，PEM修饰的钛基材可提供连续且持久的Ag释放。

大量研究表明，提供种植体初期植入后良好的抗菌环境是预防感染的关键，该实验在载银钛基材表面培养Pg，通过细菌菌落计数法和结晶紫染色法来验证材料的抗菌性能和对生物膜形成的影响。细菌菌落计数结果显示，TNT表面赋予了纯钛一定的抗菌性能，但相较于纯钛和TNT表面，不同浓度的载银均会显著提高钛基材的抗菌性能，达到90%以上，且抗菌效果随着银浓度的增大而增大，说明表面银离子的释放浓度起重要作用。结晶紫染色结果显示，随着载银浓度的增加，最终检测到的生物膜形成总量逐渐减少，减缓了50%以上的生物膜发展，其原因可能是银作用于生物膜的表面或内部，杀死其中的细菌，减少细菌的总量，从而减少生物膜的形成，控制生物膜的发展。