海洋真菌MF—08产壳聚糖酶诱导条件及酶学性质分析

李佳茵　王慧敏　祖国仁

摘要：通过研究不同摇床转速、不同碳源和碳源浓度、不同诱导碳源对海洋真菌MF-08产壳聚糖酶的影响，提高其产酶活性，并对海洋真菌MF-08产壳聚糖酶进行部分酶学性质研究。结果表明，最佳发酵条件为27℃，150 r/min，1.5%蔗糖，0.01%氨基葡萄糖，海水培养基发酵72h。该壳聚糖酶的最适作用温度为40℃，最适pH 5.2，酶活在pH 4.0～6.0范围内和0～40℃相对稳定；Cu²⁺、Fe³⁺和Hg²⁺对该酶活具有明显的抑制作用。经过培养条件的优化，该菌的最高产酶活性达到1.769 U/mL，与优化前相比提高了7.56倍。

关键词：海洋真菌MF-08；壳聚糖酶；诱导条件；酶学性质

壳寡糖是甲壳素脱乙酰化后的产物，是一种具有独特生理活性的低聚糖，属于阳离子型天然碱性多糖，这使得壳聚糖具有许多特殊的物理、化学性质及生理和药理功能。具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活等独特的生理功能，其应用前景广阔。壳聚糖在自然界广泛存在于虾、蟹及少数菌类、藻类的细胞壁中，在高等植物中还未发现壳聚糖的存在，也可由几丁质通过部分或完全脱乙酰而成，在食品、医药、农业和环保等领域有着广泛的应用价值。降解壳聚糖的方法有化学法、物理法、酶解法、电化学法等，其中酶解法具有特异性强、节能、环保、安全等优势。壳聚糖酶是一种降解壳聚糖的专一性水解酶，是理想的壳聚糖降解方法。利用酶法降解壳聚糖的研究还处在实验室研究阶段，难以实现工业化生产，关键在于尚未研究出有效获得大量的、专一性的壳聚糖酶制剂的方法。

本试验以一株产壳聚糖酶活力较高的海洋真菌为出发菌株，研究其培养条件对产酶的影响及壳聚糖酶学性质的研究，以期为壳聚糖酶工业化生产及应用提供试验依据和理论基础。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种 海洋真菌MF-08：大连工业大学微生物实验室分离保存。

1.1.2培养基 试管斜面培养基：1.0%葡萄糖，0.5%壳聚糖，0.2%蛋白胨，0.1%酵母膏，40%蒸馏水，60%陈海水，2%琼脂，自然pH，115-120℃，灭菌20 min，冷却待用。

发酵培养基（g/L）：碳源1.0%；酵母膏0.1%；蛋白胨0.5%：FePO₄0.01%：陈海水100 mL；pH 7.6；在115-121℃灭菌20 min，冷却待用。

液体种子培养基（g/L）：在无菌试管中装入5 mL发酵培养基，在115-121℃灭菌20 min，冷却待用。

无金属离子培养基：蔗糖1.5%：酵母膏0.1%；蛋白胨0.5%：去离子水100 mL；自然pH；在115-121℃灭菌20 min，冷却待用。

1.1.3仪器 不锈钢手提式蒸汽灭菌锅，上海博讯仪器厂；双层小容量全温度恒温震荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；722 s分光光度计，上海精密仪器科学有限公司；TGL-16C型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；MJP-150型霉菌培养箱、DK-S24型电热恒温水浴锅；DGG-9070B型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1粗酶液的制备 从保藏的试管斜面挑取孢子于液体发酵培养基中，37℃振荡培养72 h，取一定量发酵液，8 000 r/min离心15 min，其上清液即为粗酶液。

1.2.2酶活力测定方法 1 mL含壳聚糖0.5%（0.5g/100 mL）的乙酸缓冲液，加入1 mL粗酶液，37℃下保温30 min，煮沸5 min终止酶反应。DNS法测定还原糖。相对酶活是以同组试验的最高酶活性为1，其他酶活性与最高酶活的比值即为相对酶活。剩余酶活是经过一定处理后的酶活/原来的酶活。

1.2.3发酵培养的方法 在超净工作台内，从保存的试管斜面上挑取孢子，接入5 mL液体种子培养基中，27℃、150 r/min振荡培养24h。再接入对应装有45 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，27℃、150 r/min振荡培养72 h。考察不同摇床转速（0、50、100、150、180 r/min）、不同碳源（蔗糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、D-甘露醇、粉末性壳聚糖、可溶性壳聚糖）及碳源浓度（0.50%、1.00%、1.50%、2.00%）、不同诱导性碳源（氨基葡萄糖、胶体壳聚糖、粉末壳聚糖）及碳源浓度（0.01%、0.30%、0.50%、0.70%、0.90%）对海洋真菌MF-08产壳聚糖酶的影响。

1.2.4酶学性质的研究方法

1）最适反应温度及温度稳定性：在不同温度（30、35、40、45、50、55、60、70、80℃）下测定酶活，以确定最适反应温度。将粗酶液分别置于不同温度的恒温水浴中保温10 min，然后测定剩余酶活，以确定温度对于酶稳定性的影响。

2）壳聚糖酶的热温度性：将粗酶液分别置于不同温度（30、40、50、60℃）的恒温水浴中保温不同时间（0、10、20、30、40、50、60 min），然后测定剩余酶活，以确定壳聚糖酶的热温度性。

3）最适反应pH：采用不同pH（2.0、3.0、4.0、4.4、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、7.0、8.0）的乙酸-乙酸钠缓冲液和0，5%壳聚糖底物溶液测定壳聚糖酶活，以确定其最适反应pH。

4）壳聚糖酶oH稳定性：将粗酶液与不同pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的广泛缓冲液以1：1的体积比混合，在4℃下放置6 h，测定剩余酶活，测定壳聚糖酶的pH稳定性。

5）金属离子对壳聚糖酶活性的影响：分别向粗酶液中加入不同的金属离子（Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺），4℃静置10 min后，测定相对酶活。以不加金属离子的酶液为对照，研究不同离子对壳聚糖酶相对酶活的影响。

2.结果与分析

2，1不同摇床转速对海洋真菌MF-08产壳聚糖酶的影响

由图1可见，随着摇床转速的增大，海洋真菌MF-08产出的壳聚糖酶相对酶活先升高后降低，当摇床转速为150 r/min时，壳聚糖酶相对酶活最高，因此，选择摇床的最佳转速为150 r/min。

2.2不同碳源对海洋真菌MF-08产壳聚糖酶的影响

海洋真菌MF-08在浓度为1.0%的不同碳源条件下培养，经摇瓶振荡培养72 h，测定壳聚糖酶相对酶活，结果如图2所示。从图2可知，在碳源浓度为1.0%时，蔗糖产壳聚糖酶的效果最好，因此选用蔗糖为碳源。

2.3不同碳源浓度对海洋真菌MF-08产壳聚糖酶的影响

在培养基中添加不同浓度的碳源，以判断海洋真菌MF-08对不同碳源的利用情况，确定最佳的碳源及其浓度，试验结果如图3所示。由图3可见，碳源浓度为1.5%的蔗糖产壳聚糖酶效果最好，因此选用浓度为1.5%的蔗糖作为碳源。

2.4不同诱导性碳源对海洋真菌MF-08产壳聚糖酶的影响

采用混合培养基来培养海洋真菌MF-08，在最佳碳源基础上添加一定量的诱导性碳源，并记录菌株的产酶情况，结果如图4所示。由图4可见，添加0.01%的氨基葡萄糖进行诱导，海洋真菌MF-08产出的壳聚糖酶相对酶活最高，故采用1.5%的蔗糖添加0.01%的氨基葡萄糖作为最佳碳源。

综合以上试验，海洋真菌FM-08的摇床培养最佳转速为150 r/min，最佳碳源是1.5%的蔗糖基础上添加0.01%的氨基葡萄糖。按照最佳条件进行发酵，经过优化后海洋真菌FM-08产出的壳聚糖酶相对酶活由初始酶活0.234 U/mL优化为1.769 U/mL，提高了7.56倍。

2.5壳聚糖酶酶学性质

2.5.1壳聚糖酶反应的最适温度及温度稳定性将壳聚糖酶酶促反应体系的温度分别设定为不同的值，试验结果如图5所示。从图5可以看出，反应温度在40℃以下时，壳聚糖酶相对酶活随着温度的升高而增强，40℃时相对酶活最高，反应温度高于40℃后，相对酶活随之降低。所以，壳聚糖酶反应最适温度为40℃。

壳聚糖酶在不同温度下保温10 min后，测得的剩余酶活如图6所示。如图6可知，温度低于45℃，壳聚糖酶剩余酶活可保持在85%以上。

壳聚糖酶在30、40、50、60℃下放置不同时间后测定剩余酶活，结果如图7所示。由图7可知，在4个温度下，30℃下放置的壳聚糖酶剩余酶活基本保持稳定，40℃下壳聚糖酶剩余酶活有所下降，50、60℃下壳聚糖酶很快失活。

2.5.2壳聚糖酶的最适反应pH 由图8可以看出，随着pH的增大，壳聚糖酶相对酶活先升高后降低，在pH为5.2时达到峰值，因此壳聚糖酶的最适合反应pH为5.2。

2.5.3 pH对壳聚糖酶稳定性的影响 从图9可以看出，在4℃下放置6 h，不同pH下壳聚糖酶的剩余酶活随pH的升高先升高后降低，在pH 4.0-6.0之间剩余酶活相对稳定。

2.5.4金属离子对壳聚糖酶活性的影响 由图10可以看出，Cu²⁺、Fe³⁺和Hg²⁺对壳聚糖酶相对酶活具有很明显的抑制作用，尤其是Hg²⁺可以使壳聚糖酶完全失去活性。其他金属离子对壳聚糖酶相对酶活影响差异不大。

3.小结

海洋真菌MF-08产壳聚糖酶的最佳碳源为1.5%的蔗糖添加0.01%的氨基葡萄糖诱导性碳源。最佳摇床转速为150 r/min。在最优诱导条件下，海洋真菌MF-08产壳聚糖酶的酶活达到1.769 U/mL，相比优化前提高了7.56倍。海洋真菌MF-08部分酶学性质的研究表明，壳聚糖酶的最适作用温度和最适反应pH分别为40℃和pH 5.2，酶活在pH4.0～6.0范围内和40℃以下相对稳定：Cu²⁺、Fe³⁺和Hg²⁺对壳聚糖酶相对酶活具有明显的抑制作用，尤其是Hg²⁺可以使壳聚糖酶完全失去活性。