ESAT⁃6及CFP⁃10刺激颗粒酶B在儿童结核诊断中的价值

孙娜 姚聪 沈芯 王军 袁纯辉 向贇

1华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院（武汉430016）；2湖北中医药大学（武汉430065）

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一种高度传染性的慢性疾病，严重危害儿童健康。2018年全球新发现的结核病儿童约112 万例，死亡儿童高达20 万［1］。儿童自身免疫力弱，感染MTB 后容易发展成活动性结核，但因临床表现不典型和诊断方法自身的局限性，很容易造成漏诊、误诊。

MTB 为胞内寄生菌，进入人体后，机体免疫系统以白细胞分化抗原CD4+T 和CD8+T 淋巴细胞介导的细胞免疫为主要应答模式［2］。在小鼠感染模型中，CD8+T 细胞对于维持结核潜伏感染状态至关重要［3］。颗粒酶B（granzyme B，GrB）是发挥细胞毒作用的主要效应分子，能够迅速引起靶细胞DNA 的断裂，导致细胞凋亡［4-5］。OUNI 等［6］报道MTB 分泌抗原Rv0140 诱导的GrB 能够区分ATB和LTBI，并且淋巴结结核的发生与CD4+T 和CD8+T表达GrB 减少有关。相比于IFN⁃γ主要由CD4+T 细胞分泌，GrB 可由CD8+T 和CD4+T 共同分泌，对诊断结核可能具有更高的敏感度［7-8］。本研究通过检测6 kD 早期分泌靶向抗原（ESAT⁃6）和10 kD 培养滤过蛋白（CFP⁃10）刺激外周血单个核细胞（pe⁃ripheral blood mononuclear cells，PBMCs）后GrB 水平，评估其作为儿童结核诊断生物标志物的潜力。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器AIM⁃V 细胞培养液（天津灏洋华科生物科技有限公司）；ESAT⁃6/CFP⁃10 抗原（英国Oxford Immunotec 公司）；颗粒酶B 预包被ELISA试剂盒（北京达科为生物技术有限工司）；淋巴细胞亚群检测试剂盒、BV⁃510⁃anti⁃INF⁃γ、BV510⁃anti⁃Granzyme B、FACSCantoⅡ流式细胞仪（美国BD 公司）；固定液、破膜剂（美国BioLegend 公司）；血细胞分析仪XS⁃1000i（日本Sysmex 公司）；酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）。

1.2 研究对象选取2019年1⁃8月武汉金银潭医院就诊的结核病患者26 例作为活动性结核（active tuberculosis，ATB）组，包括19 例肺结核和7例肺外结核，其中男12例，女14例，年龄1 ～15岁，中位数6.5 岁；选取20 例武汉儿童医院T⁃SPOT阳性、但无临床相关症状及影像学证据的为结核潜伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）组，其中男14 例，女6 例，年龄9 个月～13 岁，中位数6 岁；选取有咳嗽、发热或体重减少等疑似结核临床症状，但无活动性结核病证据的患儿20 例，作为非结核病对照（Non⁃TB）组，其中男12 例，女8 例，年龄1 ～13 岁，中位数4 岁；另选取来本院体检的健康儿童20 例，作为健康对照（HC）组，其中男8 例，女12 例，年龄2 ～18 岁，中位数6 岁。将ATB 和LTBI 组合并作为结核组，Non⁃TB 和HC 组合并作为对照组。活动性结核组为既往未接受过抗结核分枝杆菌治疗的初治TB 患者。纳入标准（满足任意一项）：（1）涂片抗酸杆菌或分枝杆菌培养阳性；（2）病理活检提示结核；（3）临床表现和影像学表现符合结核性改变，且抗结核治疗有效。实验组儿童均排除HIV 感染和肝肾功能衰竭等疾病。本研究获得武汉儿童医院伦理委员会批准（2020R044⁃E01）。

1.3 单个核细胞分离外周血2～3 mL（肝素锂抗凝管）按照密度梯度离心法分离单个核细胞，使用血细胞分析仪计数制备250 000/100 μL 的细胞工作液。在96 孔板中，每个样本对应的3 个检测孔均加入100 μL 细胞工作液和50 μL AIM⁃V 细胞培养液，然后分别加入50 μL ESAT⁃6、CFP⁃10 溶液或AIM⁃V 培养液。37 ℃，5%CO2孵育20 h，取上清至-80 ℃备用。

1.4 GrB检测按照GrB预包被ELISA试剂盒说明书操作。将样本按照1∶10稀释，100 μL/孔，室温孵育2 h。洗板后加入Biotinylated antibody 工作液，室温1 h。显色后使用酶标仪读取450 nm处吸光度。

1.5 流式细胞术6 孔板中加入单个核细胞5 ×106/孔和CFP⁃10 溶液，37 ℃孵育24 h。使用淋巴细胞亚群检测试剂盒对T 细胞进行表面标记染色（PerCP 抗CD45、FITC 抗CD3、APC 抗CD4、PE 抗CD8）。固定和破膜后加入BV⁃510⁃anti⁃INF⁃γ和BV⁃510⁃anti⁃Granzyme B。流式细胞仪检测并用Flow Jo 软件分析。

1.6 统计学方法统计学分析采用SPSS 20.0软件进行，正态分布计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验、χ2检验进行，应用Medcalc 软件分析实验组ROC 曲线，并根据约登指数确定最佳cut⁃off 值，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESAT⁃6/CFP⁃10 刺激后GrB 水平ESAT⁃6/CFP⁃10 抗原未刺激孔总GrB 基线水平较高，且存在个体差异，因此结核特异性GrB 的计算方法：结核特异性GrB=总GrBESAT⁃6刺激/CFP⁃10刺激-GrB培养液对照。ESAT⁃6/CFP⁃10 刺激后，结核组总GrB、特异性GrB水平均明显高于对照组（P＜0.001），见表1。对结果进行亚组分析，总GrB、特异性GrB 在ATB 组、LTBI 组、HC 组差异均有统计学意义（P＜0.05），而ESAT⁃6 刺激后总GrB 在ATB 与Non⁃TB组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2、图1。

表1 ESAT⁃6/CFP⁃10 刺激后PBMCs 分泌的GrB 水平Tab.1 Levels of GrB in PBMCs stimulated by ESAT⁃6/CFP⁃10 ±s，%

表1 ESAT⁃6/CFP⁃10 刺激后PBMCs 分泌的GrB 水平Tab.1 Levels of GrB in PBMCs stimulated by ESAT⁃6/CFP⁃10 ±s，%

注：***P ＜0.001，ATB 和LTBI 组合并作为结核组，Non⁃TB 和HC 组合并作为对照组

分组结核组对照组例数46 40总GrB ESAT⁃6 刺激***1 091.58±449.31 766.03±364.87 CFP⁃10 刺激***1 208.41±451.14 765.53±304.54未刺激768.49±262.05 753.96±262.22特异性GrB ESAT⁃6 刺激***323.09±219.11 12.07±114.34 CFP⁃10 刺激***439.92±245.99 11.58±111.02

2.2 GrB 对结核组的鉴别诊断效能以结核组和对照组作为分类变量进行ROC 曲线分析显示，CFP⁃10 刺激后总GrB、ESAT⁃6 特异性GrB、CFP⁃10特异性GrB 的最佳临界值分别为981.86、117.93、162.81 pg/mL 时，诊断结核组的敏感度为69.57%、86.96%、86.96%，特异度为82.5%、82.5%、90%，AUC为0.793、0.923、0.96，见图2。对比显示，CFP⁃10 特异性GrB对结核组和对照组的鉴别诊断效能最高。

表2 ESAT⁃6/CFP⁃10 刺激后PBMCs 分泌的GrB 水平在各亚组间的差异Tab.2 Comparison of the levels of GrB in PBMCs stimulated by ESAT⁃6/CFP⁃10±s

表2 ESAT⁃6/CFP⁃10 刺激后PBMCs 分泌的GrB 水平在各亚组间的差异Tab.2 Comparison of the levels of GrB in PBMCs stimulated by ESAT⁃6/CFP⁃10±s

总GrB特异性GrB ESAT⁃6CFP⁃10ESAT⁃6CFP⁃10 970.65±339.481 040.36±361.58211.72±134.57281.43±158.66 ATB LTBI HC Non⁃TB P 值（ATB vs.LTBI）P 值（ATB vs.HC）P 值（ATB vs.Non⁃TB）P 值（HC vs.Non⁃TB）1 248.79±510.56 713.66±360.76 818.39±352.09 0.036 0.02 0.154 0.371 1 426.86±451.16 721.79±294.29 809.27±300.70 0.003 0.003 0.012 0.370 467.87±217.7 22.42±110.99 1.71±113.83＜0.001＜0.001＜0.001 0.574 645.94±168.32 30.55±123.67-7.4±89.56＜0.001＜0.001＜0.001 0.285

2.3 GrB 对ATB 与LTBI 组的鉴别诊断效能以ATB 组和LTBI 组作为分类变量进行ROC 曲线分析显示，CFP⁃10 刺激后总GrB、ESAT⁃6 特异性GrB、CFP⁃10 特异性GrB 的最佳临界值分别为1 214.39、269.36、423.67 pg/mL 时，用来区分ATB与LTBI组的敏感度分别为70%、85%、90%，特异度为80.77%、76.92%、84.62%，AUC 为0.735、0.856、0.923，见图3。对比显示，CFP⁃10 特异性GrB 对ATB 和LTBI组的鉴别诊断效能最高。

2.4 不同方法对结核组的诊断效能比较CFP⁃10刺激后特异性GrB 的临界值为162.81 pg/mL 时，与T⁃SPOT、抗酸染色、Xpert MTB/RIF 区分结核组的效能进行比较显示，特异性GrB 对结核诊断的敏感度、阴性预测值和准确度均高于其余三种方法（P＜0.01），见表3。

表3 不同检测方法对结核的诊断效能评估Tab.3 Comparison of TB diagnosis among different detection methods

2.5 流式检测CD8+T、CD4+T 细胞IFN⁃γ和GrB的表达为进一步探究GrB 对结核诊断的潜在机制，通过流式细胞仪检测CFP⁃10 刺激ATB 患者和健康对照（HC）外周血单个核细胞后CD4+T 和CD8+T 细胞分泌的GrB、IFN⁃γ水平。结果显示ATB组表达GrB 的CD4+T［（38.90±11.96）%］、CD8+T［（36.82±8.99）%］细胞明显高于HC组CD4+T［（7.36±3.67）%］、CD8+T［（8.29±3.58）%］，P＜0.001）；而ATB 组仅表达IFN⁃γ的CD4+T［（34.18±8.07）%］细胞显著高于HC 组［（4.06 ± 2.44）%］，差异有统计学意义（P＜0.001），见图4。以上结果表明GrB 可由CD4+T、CD8+T 细胞同时分泌，而IFN⁃γ主要由CD4+T 细胞分泌。

3 讨论

儿童痰液标本采集困难，目前基于痰液标本的多种检测手段在结核感染诊断中具有较低的效能，如痰涂片在活动性肺结核中的检出率只有16.4%［9］。2017年，基于PBMCs的γ⁃干扰素释放试验（interferon gamma release assay，IGRA）被纳入结核诊断标准（WS288⁃2017）。SOLLAI 等［10］人使用meta分析发现结核感染T 细胞斑点试验（T⁃SPOT.TB）和QuantiFERON⁃TB Gold（QFT）这2 种IGRAs 对诊断儿童结核的特异度高于90%，但敏感度较低，为47%～81%。此外，2018年MYRIAM等报道IGRA在HIV 感染合并ATB 患儿中，诊断ATB 的敏感度只有29%［11-12］，这可能是由于IFN⁃γ主要由CD4+T细胞分泌所致。本研究发现CFP⁃10 特异性GrB 区分结核组和对照组敏感度高达86.96%，敏感度高于IGRAs。

图1 ESAT⁃6/CFP⁃10 刺激后总GrB 和特异性GrB 的水平Fig.1 Levels of total and MTB⁃specific GrB in PBMCs stimulated by ESAT⁃6/CFP⁃10

图2 ESAT⁃6/CFP⁃10 刺激后GrB 区分结核组与对照组的ROC 曲线Fig.2 The ROC curves of GrB to discriminate patients with TB from control stimulated by ESAT⁃6/CFP⁃10

图3 ESAT⁃6/CFP⁃10 刺激后GrB 区分ATB 组与LTBI 组的ROC 曲线Fig.3 The ROC curves of GrB to discriminate patients with ATB from LTBI stimulated by ESAT⁃6/CFP⁃10

图4 ATB 患者和HC 对照外周血CD4+T 细胞、CD8+T 细胞在CFP⁃10 刺激前后IFN⁃γ和GrB 的表达水平Fig.4 Qualitative analysis of GrB and IFN⁃γ expression ex vivo in CD4+/CD8+T cells stimulated by CFP⁃10 from patients with ATB and HC

SARKAR 等［13］研究发现GrB 可以作为合并感染HIV 的结核病人的一个诊断标志物。在本研究中，结核抗原活化的CD4+T 和CD8+T 细胞均能分泌GrB，同时既往文献证实NK 细胞也能分泌GrB［14］，这可能是GrB 对结核诊断敏感度优于IGRAs 的原因。QuantiFERON⁃TB Gold Plus（QFT⁃Plus）在QFT的基础上添加了诱导CD8+T 细胞免疫应答的新抗原肽段以提高敏感度，但仍不能鉴别ATB 和LTBI［15］。COMELLA⁃DEL⁃BARRIO 等［16］报道INF⁃γ需联合IP10、铁蛋白和25⁃羟维生素D才具有鉴别儿童ATB与LTBI 的潜力。TOGUN 等［17］研究表明检测QFT⁃GIT 实验上清中的一些其他细胞因子（如IP⁃10、IL⁃5、IL⁃13）具有区分儿童LTBI 和ATB 的潜力。在本研究中，单独GrB 就具有区分ATB 和LTBI 的潜能，这可能是由于CD8+T 细胞是控制结核潜伏感染状态的关键细胞，GUGGINO 等［18］也证实CD8+T 分泌的颗粒酶A 可鉴别LTBI 和ATB。由上述可见，联合检测结核抗原特异性GrB 和IFN⁃γ可提高儿童结核诊断敏感度，并具有区分ATB和LTBI的潜能。

检测发现各实验组抗原未刺激孔总GrB 的基线水平较高，且存在个体差异，综合分析提出结核特异性GrB 的概念。WANG 等［19］研究报道ESAT⁃6/CFP⁃10 抗原特异性TNF⁃α对ATB 的诊断效能显著优于总TNF⁃α。本实验结果显示ESAT⁃6 刺激后ATB 组总GrB 在ATB 与Non⁃TB 组间无统计学差异，而CFP⁃10刺激组总GrB和特异性GrB对结核的诊断效能均优于ESAT⁃6 组。原因可能是ESAT⁃6蛋白可通过C 端6 个氨基酸与TLR2 或是β2 微球蛋白直接相互作用，激活TBK1 和IRF3 信号轴，从而抑制宿主巨噬细胞抗原呈递和炎症因子释放等多种功能，而CFP⁃10 则不具有免疫抑制功能［20-22］。这两种结核抗原对GrB 释放的分子水平差异有待进一步研究证实。

结核特异性GrB 具有作为新型结核诊断生物标志物的潜能，对儿童活动性结核的鉴别诊断具有重要价值。但由于儿童初治和确诊为活动性结核的标本收集困难，本实验纳入方法学评价的样本例数不多，GrB 对结核的诊断效能仍需要扩大样本量来进一步证实。