碱性成纤维细胞生长因子凝胶缓解氯倍他索反复涂抹联合胶带剥离术导致的小鼠皮损

熊璎珞 杨波 陈建文 薛琦 方海洲 张革

1中山大学药学院微生物与生化药学系（广州510006）；2珠海亿胜生物制药有限公司研发中心（广东珠海519085）；3中山大学药学院（广州510006）；4亿胜生物科技（中国香港999077）

肾上腺皮质激素，发挥着抑制炎症信号传导的重要功能，被广泛应用于慢性湿疹、银屑病等疾病的治疗［1］。临床上长期接触激素反而造成皮肤局部萎缩甚至皲裂等副作用［2］，但其具体机制仍有待阐明。FEINGOLD 研究组和李远宏主任医师分别通过在无毛小鼠上涂抹氯倍他索后行胶带剥离操作和在豚鼠皮肤中反复涂抹丙酸氯倍他索，造成短期和长期接触激素诱导的皮损和角化不全［3-4］，有效的模拟了临床上激素长期接触导致的皮肤局部损伤和功能失调的表型。目前激素依赖导致的皮损皮炎治疗遵循戒断激素、加强护理、综合治疗的原则来对患者进行临床干预和观察［5］。钙调神经酶抑制剂他克莫司可通过抑制炎症迅速缓解激素依赖性皮炎的干燥紧绷感［6］。聂元梅等用蓝肤科宁护肤品治疗激素依赖性皮炎发现治疗后患者症状体征评分明显低于治疗前及对照组［7］。近年来越来越多的临床研究关注生长因子类药物在激素依赖性皮炎缓解中的疗效［8］。

碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）可广谱性的促进外胚层和中胚层来源的细胞的增殖、迁移和分化，具有促进组织修复、骨骼发育和维持代谢稳态等重要的生理作用［9］，已成为皮肤创伤、溃疡和组织修复的重要候选药物［10］。然而，bFGF 在长期激素接触导致的皮损和皮炎副作用中的功能尚未被阐明，深入研究bFGF 在其中的修复作用和机制，具有强大的理论科研价值和应用前景。

本文在氯倍他索诱导的小鼠皮损模型上使用bFGF 凝胶干预，研究其对治疗组小鼠表皮失水率和坏死、皮肤炎性浸润的影响，且体外鉴定氯倍他索对人角质形成细胞的紧密连接蛋白表达的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）、0.25% 胰蛋白酶⁃EDTA 溶液（Gibco），100×青霉素⁃链霉素溶液、溴化噻唑蓝四氮唑（MTT）、丙二醇溶液、5×蛋白上样缓冲液、ECL 超敏化学发光试剂盒购自生工生物工程有限公司，RIPA 细胞裂解液（Thermo Fisher），anti⁃Claudin 1 抗体（Cell Signaling Technology），anti⁃Claudin 2 抗 体（Lifespan Biosci⁃ences），anti⁃GAPDH 抗体（Proteintech），丙酸氯倍他索（Sigma），bFGF 重组蛋白由珠海亿胜生物制药有限公司通过基因重组技术由大肠杆菌发酵后获得，与卡波姆、甘油和羟苯乙酯辅料一起制备为凝胶。

1.2 实验动物饲养及造模SPF 级6 ～8 周龄的C57BL/6J 雌鼠购自广东省实验动物中心，饲养于中山大学实验动物中心SPF 级屏障环境动物房内，给药及造模均于屏障内进行。将小鼠背部剃毛暴露2 cm × 2 cm 面积的皮肤，按7 只每组分为3 组：一组为溶媒对照涂抹溶解氯倍他索的试剂丙二醇∶乙醇7∶3（体积比）；一组为造模组涂抹0.05%的氯倍他索溶液，每天给药2 次，持续7 d；一组为造模并给予bFGF 外用凝胶干预组，在每次涂抹完氯倍他索溶液30 min 后，涂抹含bFGF 20 μg/g gel 的外用凝胶（同时前两组涂抹同样体积的空辅凝胶，即包含卡波姆、甘油和羟苯乙酯的凝胶）。最后一次给药后24 h，使用无菌敷贴在给药部位进行胶带剥离操作4 次，并在胶带剥离完成时和12 h 后拍照记录背部皮肤外观。

1.3 小鼠表皮水分流失测定在胶带剥离术后12 h 固定小鼠，将手持VapoMeter 皮肤水分测定仪紧贴于小鼠背部皮肤，读取经表皮水分流失（trans epidermal water loss，TEWL）读数，连续测量两次，取平均值。

1.4 小鼠皮肤组织H&E 染色及病理分析皮肤组织经多聚甲醛固定后进行石蜡包埋切片，按文献中方法行H&E 染色［11］。在ZEISS Axiocam ERc 5s 高倍（200 ×）光学显微镜下行切片拍照，并分析组织内表皮脱落和组织炎性浸润情况。认定核质固缩的细胞为死细胞，鉴定多型分裂核、胞质浅染的细胞为中性粒细胞，同时对具有明显血管腔壁和红细胞的血管进行多视野计数。

1.5 人角质形成细胞系HaCaT的体外培养永生化的人角质形成细胞系HaCaT 购于中国科学院上海生物与化学研究所，将HaCaT重悬于含有10%FBS和1% 青霉素⁃链霉素溶液的DMEM 培养液中，置于37 ℃、5% CO2环境中进行培养，24 h 后细胞呈贴壁状态。每隔2 天换一次液，待细胞生长到融合度90%以上时，用0.25%的胰蛋白酶⁃EDTA 溶液消化后，按1∶5 的比例进行传代，约3 ～4 d 传代一次，取第3 ～7 代细胞开展后续实验。

1.6 氯倍他索体外刺激后细胞活力及紧密连接蛋白检测将HaCaT 按1 × 104/孔的密度接种于96孔板中，培养过夜至贴壁状态后，更换含0.2%FBS的条件培养液，血清饥饿过夜。向培养体系中加入氯倍他索溶液至工作浓度分别为20、40、60、80 μg/mL（对照组给予等体积的DMSO），将孔板置于37 ℃、5% CO2环境中培养72 h。然后向培养体系中加入MTT 溶液至终浓度为5 mg/mL，继续孵育4 h 后弃去培养液，向孔板中加入DMSO：无水乙醇体积比1∶1 配置的细胞裂解液（120 μL/孔），振荡10 min 后于Molecular Devices 多功能酶标仪上记录570 nm 和630 nm 处的吸光值，计算给药组相对对照组的细胞活力（%）。或将HaCaT 按2×105/孔的密度接种于12 孔板中，培养和给药方法一致，氯倍他索刺激24 h 后使用RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，通过Western blotting 方法［12］检测紧密连接蛋白Claudin 1，Claudin 2 的表达水平。

1.7 统计学方法所有实验数据均在GraphPad Prism 5 软件中进行统计学分析，连续数据以形式表示，采用One⁃way ANOVA 方法统计数据，以P＜0.05 为差异有统计意义。

2 结果

2.1 bFGF 凝胶干预显著减缓氯倍他索涂抹联合胶带剥离造成的小鼠背部皮损处死小鼠前拍照记录小鼠背部皮肤外观可发现，造模组的小鼠皮肤在胶带剥离完成时和12 h 后均存在严重皮损，表现为表皮发红、水肿且存在明显外伤未愈合（图1B，1D），而涂抹溶媒的对照组小鼠皮肤只在胶带剥离刚完成时可见表皮轻微红肿，12 h 后基本恢复正常（图1A，1C）。给予了bFGF 外用凝胶的小鼠在胶带剥离完成时皮肤红肿程度显著弱于单独氯倍他索造模的小鼠（图1B，1C），12 h 后皮损面积也明显减小（图1E，1F）。

图1 胶带剥离完成时与胶带剥离操作12 h 后小鼠背部皮肤照片Fig.1 Back photos of mice just after tape⁃stripping and 12 hours post tape⁃stripping

2.2 bFGF凝胶干预显著降低氯倍他索反复涂抹联合胶带剥离增加的表皮失水率胶带剥离完成12 h后检测小鼠背部表皮水分流失，发现给予了氯倍他索的造模组小鼠表皮失水率（38.83 ± 1.85 g/m2h）显著高于溶媒对照小鼠（16.93±0.79 g/m2h），而涂抹了bFGF 凝胶后小鼠背部表皮失水率（31.12 ±1.77 g/m2h）明显降低（表1），但仍高于溶媒对照组（图2）。

2.3 bFGF凝胶干预显著减少造模组表皮细胞坏死和皮肤炎性浸润小鼠皮肤组织H&E 染色显示，溶媒对照组表皮层结构完整，鳞状上皮细胞形态正常、排列紧密；真皮层胶原纤维丰富、排列规则（图3A）。造模组可见大量表皮层细胞核固缩，胞质嗜酸性增强，细胞体积减小（黑色箭头），大面积真皮层细胞坏死，核碎裂（黄色箭头），伴有较多中性粒细胞浸润（蓝色箭头、图3B）。涂抹bFGF 凝胶干预后小鼠的表皮层细胞核固缩和真皮层细胞坏死状况得到明显改善，同时中性粒细胞的浸润减少（图3C）。

表1 胶带剥离12 h 后小鼠表皮失水率测定Tab.1 Detection of trans epidermal water loss at 12 hours post tape⁃stripping

图2 胶带剥离12 h 后小鼠表皮失水率测定Fig.2 Detection of trans⁃epidermal water loss at 12 hours post tape⁃stripping

2.4 bFGF 凝胶干预改善造模组皮下组织出血小鼠皮肤组织H&E 染色显示，氯倍他索造模组小鼠皮下组织局部可见轻度出血和血管数目增加（图3 B 红色箭头），高倍镜视野下进行血管计数发现造模发生皮损后小鼠皮下组织血管生成数目相比溶媒组小鼠急剧增多，而bFGF 凝胶干预组小鼠血管数目明显减少（图4）。

3 讨论

本研究中的激素涂抹联合胶带剥离改良造模方法可造成小鼠皮肤损伤，此表型有效的模拟了临床上激素依赖导致的皮损和皮炎副作用。而给予bFGF 凝胶干预可有效减弱皮损，表现为表皮失水率的减少，表皮层细胞大量坏死和出血情况的改善。本研究采样时间点检测到造模组皮损程度和表皮失水率仍显著高于溶媒组，但bFGF 凝胶干预组外伤已基本愈合，提示bFGF 加速了表皮组织屏障功能的修复。在FEINGOLD［13］的研究中，单独胶带剥离实验可诱导IL⁃1α，IL⁃1β，IL⁃6，TNF⁃α，GM⁃CSF 等炎症因子表达的上调，同时伴随中性粒细胞向组织局部聚集。此外，持续的bFGF 刺激可以下调炎症因子IL⁃1 或TNF⁃α诱导的中性粒细胞内皮粘附和经内皮迁移［14］。本研究中使用bFGF干预凝胶检测到皮损局部中性粒细胞炎性浸润较单独使用激素组明显降低，提示皮肤损伤恢复期bFGF 可介导局部炎症应答减弱，该内容需要进一步体内外实验进行验证。

图3 各组小鼠皮肤组织H&E 染色（200×）Fig.3 H&E staining of skin tissue of mice in each group（200×）

图4 高倍镜（200×）下小鼠皮下组织血管计数Fig.4 Vascular counting in mouse subcutaneous tissue in high magnification（200×）

此外，本研究发现bFGF 凝胶干预后小鼠皮肤的出血情况得到改善，真皮组织和皮下组织区血管数目显著减少。随着bFGF 对于新生血管作用研究的加深，bFGF 已从一种简单的促血管生成细胞因子［15］，逐渐被发现为在微环境中参与血管重塑的因子［16］，持续的bFGF 释放还可能通过抑制内皮的活化和免疫细胞的募集从而调控炎症［14］。本文诱导的皮损模型中发现，血管数目的增加与组织损伤和炎症反应程度呈正相关，而与bFGF 凝胶无直接关联。

图5 不同浓度氯倍他索刺激的人角质形成细胞HaCaT 细胞活力测定和紧密连接蛋白水平测定（200×）Fig.5 Determination of HaCaT cell viability and tight junction protein in human keratinocytes stimulated by different concentrations of clobetasol（200×）

长期接触氯倍他索会造成皮肤局部萎缩甚至皲裂等副作用［17］，但其中的细胞分子机制尚不明确。VIENNET 组鉴定了不同种类和浓度的肾上腺皮质激素对人角质形成细胞HaCaT 的增殖抑制作用［18］，FEINGOLD 发现［3］短期反复涂抹氯倍他索的小鼠皮肤角质层细胞间脂质前体合成显著减少，从而使表皮通透性增强。而Claudin 蛋白作为主要表达于表皮层中的重要的紧密连接蛋白家族，形成细胞间的紧密连接并调节各类小分子的跨表皮内外渗透［19］，因此检测其在激素接触条件下的细胞和组织水平，对鉴定表皮的通透性具有重要指示意义。本实验验证了氯倍他索对HaCaT细胞增殖的抑制作用，同时开创性的通过免疫印迹法鉴定发现氯倍他索下调Claudin 1 和Claudin 2蛋白的表达（图5），对后续研究氯倍他索等糖皮质激素造成的皮肤不良反应研究提供了新的思路。

总之，bFGF 凝胶有效的保护和缓解了激素反复接触联合机械外力造成的实验性小鼠皮损，为以外源性bFGF 为活性成分的药物应用于临床上激素依赖性皮损皮炎的治疗提供了一定的理论支撑和研发思路。