酒萸肉超高效液相色谱指纹图谱的建立及化学计量分析*

李永鹏，卜晨琛，宋 霞，刘亚蓉

（青海省药品检验检测院·青海省中藏药现代化研究重点实验室，青海 西宁 810000）

山茱萸有补益肝肾、收涩固脱功效，临床用于治疗眩晕耳鸣、腰膝酸软、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等症［1］。山茱萸经酒炮制后补益功能增强，六味地黄丸、知柏地黄丸等经典名方均以酒萸肉为原料［2-3］，但 2015 年版《中国药典 （一部 ）》尚未区分山萸肉和酒萸肉的质控指标。为了全面评价酒萸肉的质量和现行标准的可行性，本研究中采用超高效液相色谱（UPLC）法测定酒萸肉多指标成分的含量，并建立指纹图谱，为酒萸肉的临床应用、炮制和资源开发提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Acquity 型超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；BSA224SCW 型电子分析天平（德国Sartorius 公司，精度为十万分之一）；N-1001 型旋转蒸发仪（东京理化机械株式会社）；Milli-QA10 型超纯水器（德国Merck Millipore 公司）；KQ-500DE 型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；Chempattern 化学计量学软件（北京科迈恩科技有限公司）。

1.2 试药

没食子酸对照品（批号为110831-201605），5-羟甲基糠醛对照品（批号为111626-201610），莫诺苷对照品（批号为111637-201609），马钱苷对照品（批号为111640-201707），獐牙菜苷对照品（批号为111742-200501），含量均大于98%，均购自中国食品药品检定研究院；山茱萸新苷对照品（上海科哲生物科技有限公司，批号为Y14M10H88277，含量＞98%）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。山茱萸药材均来自2019 年国家药品评价性抽验计划抽验样品，经青海药品检验检测院鉴定为山茱萸科植物山茱萸 Cornus officinalis Sieb.et Zucc. 的干燥成熟果肉，其中 10 批为山萸肉，76 批为酒萸肉（黄酒炮制品）。酒萸肉药材信息见表1。

2 方法与结果［4-14］

2.1 色谱条件

色谱柱：ACE3 C18-AR 柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm）；流动相：乙腈（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表 2）；流速：0.2 mL ／min；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃；进样量：1 μL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、山茱萸新苷对照品各10 mg，精密称定，分别置50 mL 容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容，得各单一对照品贮备液；分别取1.0 mL，置同一10 mL 容量瓶中，用80%甲醇定容，即得上述6 种成分质量浓度分别为 24.62，35.79，59.16，9.28，43.05，18.09 μg ／mL 的混合对照品溶液。

供试品溶液：取样品（编号为005）粉末（过3 号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

精密度试验：取样品（编号为005）适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定6 次，以马钱苷峰为参照峰计算。结果各特征峰相对保留时间的 RSD 小于 1% （ n ＝ 6），单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰相对峰面积的 RSD 小于2%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置 0，2，4，6，8，12，24 h，按 2.1 项下色谱条件进样测定，以马钱苷峰为参照峰计算。结果各特征峰相对保留时间的 RSD 小于1%（n ＝7），单峰面积占总峰面积的比例大于2%的特征峰相对峰面积的 RSD 小于2%（ n ＝7），表明供试品溶液室温下放置24 h 内基本稳定。

重复性试验：取样品（编号为005）适量，精密称定，共 6 份，按 2.2 项下方法制备供试品溶液，再按 2.1 项下色谱条件进样测定，以马钱苷峰为参照峰计算。结果各特征峰相对保留时间的 RSD 小于 1% （ n ＝ 6），单峰面积占总峰面积的比例大于2%的特征峰相对峰面积的 RSD 小于2% （ n ＝6），表明方法重复性良好。

表1 76 批酒萸肉药材样品来源和指纹图谱相似度评价Tab.1 Information about the origin of 76 batches of wine-prepared Fructus Corni and their fingerprint similarity

表2 流动相梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution programs of the mobile phase

2.4 指纹图谱研究

指纹图谱建立：取酒萸肉药材样品76 批，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，指纹图谱见图1。根据结果，采用Chempattern 化学计量学软件分析数据，设编号005 样品的色谱图为参照图谱，其他样品的色谱峰与参照图谱进行自动匹配，即得酒萸肉共有模式的对照指纹图谱，见图2。将76 批酒萸肉药材样品的指纹图谱均导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012 版），计算相似度，结果76 批酒萸肉药材样品中有60 批的相似度大于0.8，10 批的相似度小于0.7，详见表1。结果表明，不同来源酒萸肉存在差异。

图1 76 批酒萸肉药材样品超高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 UPLC fingerprints of 76 batches of wine-prepared Fructus Corni

特征峰标定：根据76 批酒萸肉的特征图谱测定结果，共标定7 个特征峰。与对照品比对并结合图谱可知，1 号峰为没食子酸，2 号峰为5-羟甲基糠醛，3 号峰为莫诺苷，4 号峰为马钱苷，5 号峰为獐牙菜苷，7 号峰为山茱萸新苷；6 号峰成分未定。

酒萸肉和山萸肉指纹图谱比较：取10 批山萸肉药材样品粉末，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，色谱图见图3，根据结果，采用Chempattern 化学计量学软件分析数据，并计算酒萸肉和山萸肉指纹图谱的相似度，结果10 批山萸肉样品相似度分别为 0.38，0.54，0.60，0.53，0.54，0.56，0.53，0.56，0.54，0.53，详见图 4。结果表明，山茱萸炮制前后的指纹图谱差异较大。

2.5 化学计量学分析

聚类分析：以各参照峰面积相对峰面积为变量，以Chempattern 化学计量学软件进行聚类分析，采用误差平方和法，以欧氏距离为样品测度，聚类分析结果见图5。结果76 批酒萸肉药材和10 批山萸肉药材聚为两大类，两大类的5-羟甲基糠醛含量差异明显。其中有8 批山萸肉（编号分别为 077，142，214，215，249，315，333，334）与酒萸肉聚为一类，两者相似度均小于0.7，5-羟甲基糠醛峰基本未检出，提示炮制不到位。

图4 酒萸肉与山萸肉药材样品相似度评价Fig.4 Similarity of wine-prepared Fructus Corni and Fructus Corni

图5 酒萸肉与山萸肉药材样品聚类分析Fig.5 Cluster analysis of wine-prepared Fructus Corni and Fructus Corni

图6 酒萸肉与山萸肉药材样品主成分分析Fig.6 Principle component analysis of wine-prepared Fructus Corni and Fructus Corni

主成分分析：采用Chempattern 化学计量学软件将76 批酒萸肉药材样品和10 批山萸肉药材样品的峰面积进行标准化处理，再行主成分分析（见图6）。结果编号为 36，176，324，325，xx2 的酒萸肉药材样品产生明显偏离，其余71 批药材样品基本聚集在一起。其中6 号峰（未知）对样品36 和样品176 偏离贡献大，2 号峰（5-羟甲基糠醛）对样品xx2、样品324、样品325 的偏离贡献大；其余个别样品有向2 号峰偏离，表明2 号峰对酒萸肉影响较大，与聚类分析结果相一致。

3 讨论

采用二极管阵列检测器在190 ～400 nm 波长范围内对对照品溶液进行全波长扫描，考察了乙腈-磷酸溶液、甲醇-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液、甲醇-甲酸流动相系统不同梯度洗脱条件，对 ACE3 C18- AR 柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm），Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm），Agilent Zorbax RRHD Extend C18柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm）进行了优选，筛选 0.1，0.2，0.3，0.4 mL ／ min 的流速，以及 25，30，35 ℃的柱温，最终按选定色谱条件进样测定。结果显示，各色谱峰信息最多，各成分分离情况良好，可用于酒萸肉的指纹图谱研究。

利用聚类分析对酒萸肉指纹图谱进行评价，发现样品可分为两大类，其中48 批药材样品聚为一类，28 批药材样品聚为第二类。进一步研究共有峰发现，第二类药材样品中5-羟甲基糠醛峰面积较大，提示5-羟甲基糠醛是聚群的主要原因，主成分分析也得到此结果。在相似度统计中有8 批药材样品相似度低于0.7，聚类分析时与山萸肉在一个大类中，提示炮制不到位。进一步进行主成分分析发现，5-羟甲基糠醛对其偏离贡献较大，与聚类分析结果相呼应。5-羟甲基糠醛为山萸肉酒制后得到的新产物，其含量反映炮制工艺的稳定性及优良性，酒萸肉炮制方法为取净山萸肉，用黄酒拌匀，待酒被吸尽后，装罐内密封隔水炖或置蒸器内蒸制，用武火加热至山萸肉色变黑润，而5-羟甲基糠醛偏离的8 批药材样品颜色均未达到黑润，原因为炮制时间不足［15］，需在酒萸肉质量控制中加以注意。

综上所述，该研究所建立的超高效液相色谱指纹图谱可为酒萸肉的质量评价提供参考。