人PBMC 中免疫蛋白酶体亚基LMP7 酶活力的检测

成彦，凌春莹，罗亚鸽，陈宝龙，孙瑞

河南省洛阳正骨医院（河南省骨科医院）生化研究室，河南洛阳 471000

免疫蛋白酶体是一种具有多相催化活性的蛋白酶复合体，它广泛存在于血源性细胞，尤其是淋巴细胞和单核细胞中， 并直接参与了免疫系统的运作，在抗原呈递、免疫应答等过程中扮演关键角色[1-4]。 免疫蛋白酶体亚基LMP7 在多种自身免疫性疾病中被认定为重要的自身抗原，针对它们的自身免疫反应可能与炎症反应相关[5]。 免疫蛋白酶体促进Th 细胞分化，RA 细胞模型中，LMP7 受抑制可导致90% IL-23 的产生受抑制， 及 50% TNF-α 和 IL-6 受抑制； 抑制LMP7 活性，可缓解类风湿性关节炎小鼠模型病情[6]，提示LMP7 与RA 存在一定联系，其表达、活性极有可能参与了RA 的发生、发展，但目前此方面研究较少。

迄今，有关人PBMC 中LMP7 酶活力的测定方法尚未见报道。 该研究拟在荧光法的基础上，采用单因素实验法对LMP7 活性测定条件进行优化， 确定人PBMC 中LMP7 酶活力测定的最优化条件， 以LMP7酶活力为依据，为进一步探究其在RA 发生、发展中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

荧 光 多 肽 底 物 Ac-ANW-AMC、DMSO、Ficoll-Paque、无菌 PBS pH 7.2～7.4，其它试剂为分析纯。

底物溶液配制： 荧光多肽底物Ac-ANW-AMC，底物原包装2 mg，轻微离心，加入169.8 μL DMSO 制成20 mM 底物母液，分装并储存于-20℃。 使用时，用DMSO 稀释为2 mM 工作液。

反应缓冲液：pH 8.0 Tris-HCl 50 mM，NaCl 150 mM，Glycerol 10%，SDS 0.01% (w/v)[11]。

1.2 仪器

多功能酶标仪（Spectramax i3x MD）；高速冷冻离心机 （5804R Eppendorf）； 分析天平 （XS205 METTLER-TOLEDO）；pH 仪（S220 METTLER-TOLEDO）；超纯水仪（EASYPure II Barnstead）；超净工作台（SWCJ-1FD 苏州安泰）。

1.3 实验方法

1.3.1 PBMC 分离 依照单位伦理委员会批准的实验方案。取健康受试者或RA 患者空腹外周静脉血3 mL，肝素抗凝。超净台中进行细胞分离。3 mL 外周血加入等体积常温 PBS（pH 7.2～7.4）缓冲液稀释，15 mL 离心管事先加入3 mL Ficoll 淋巴细胞分离液， 倾斜离心管，缓慢小心地将混合均匀的PBS 和全血混合液加入分离液上层，20℃，400 g，快加速慢减速，离心 20 min；小心移出离心管，应可见4 层分离。上层血清，云雾层PBMC，中层 Ficoll， 下层为血浆。 使用 1 000 μL 移液枪，尽可能吸取云雾层，移入另一支15 mL 离心管，加入 10 mL 冷 PBS 充分洗涤，20℃，100 g，离心 10 min；弃上清， 轻弹试管， 加入10 mL 冷PBS 重悬细胞，20℃，100 g，离心 10 min，弃上清，加入 500 μl 反应缓冲液，重悬细胞，台盼蓝染色进行细胞计数。

1.3.2 细胞冻存及裂解 用反应缓冲液调整PBMC 细胞悬液浓度至 5×106个/mL，按每管 100 μl 细胞悬液进行分装，置于液氮中冷冻。

1.3.3 LMP7 酶活力检测 利用多肽荧光底物Ac-ANW-AMC， 通过检测 37℃下，30 min 内多肽底物的水解速度，即荧光产物AMC 的产生速度Vmax，检测免疫蛋白酶体亚基LMP7 的活性。

冷水浴解冻细胞悬液， 用冰反应缓冲液稀释PBMC 细胞悬液至一定浓度，置于冰上待测。 在96 孔板的一个孔内加入99 μl 稀释的PBMC 细胞悬液，加入 1 μl 稀释的 Ac-ANW-AMC 底物液，37℃避光孵育10 min， 启动反应。 Spectramax i3x 酶标仪设定为37℃，发射波长λex=360 nm，激发波长λem=460 nm，动力学方法检测30 min，使用一级动力学方程描述荧光强度的变化值与时间之间的关系曲线[7]，记录最大反应速度Vmax（单位U）及线性判定系数R2。

1.3..4 PBMC 细胞浓度（LMP7 酶浓度）优化

参照前期RA 患者PBMC 中LMP7 蛋白表达检测结果，及已有LMP7 in vitro 活力检测的相关报道[7]，选择设定 PBMC 细胞浓度为 1 000 个/μl，500 个/μl，250 个/μl 以及 125 个/μL。 每个处理设置平行实验 3次，包含健康受试者1 例，RA 患者2 例，每个实验设3 次重复。

1.3.5 细胞冻融循环次数优化 免疫蛋白酶体极不稳定，其活性对机械方法及Triton 等化学试剂特别敏感[8]，冻融裂解可能是裂解的首选方法。将PBMC 细胞悬液在液氮中冷冻10 min 后，冷水浴中解冻细胞悬液，设为一个冻融循环。 为进一步优化裂解效果，将同一样品分别进行1～5 次冻融后，检测LMP7 酶活力。

1.3.6 细胞冻存时间对酶活力的影响 PBMC 在液氮中冷冻 10 min，3 h，1 d，3 d，7 d，14 d，21 d 及 28 d后，冷水浴解冻，检测LMP7 活力。

1.4 统计方法

该次研究采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，R2为红性相关的判定系数。

2 结果

2.1 LMP7 酶浓度的优化

分别考察不同细胞浓度（酶浓度）下，Vmax 以及R2的变化， 检测结果见表 1。 在 3 个样本中， 不同PMBC 细胞浓度（酶浓度）组均表现出一定LMP7 酶活力，但不同样本、不同PBMC 细胞浓度下，LMP7 酶活力差异较大。

图1 PBMC 细胞浓度对LMP7 酶活力检测的影响

3 个样品中，酶活力与酶浓度（细胞浓度）均呈正相关。 其中健康受试者PBMC（样品3）中LMP7 酶活力低于 RA 患者（样品 1，样品 2）。 样品 1，样品 2 中，当 PBMC 细胞浓度＞250 个/μl 时， 线性相关系数 R2＞0.95，见图1（a），显示该体系较好地符合一级反应动力学方程 Vmax=K3[E]，当 PBMC 细胞浓度为 125 个/μL时，R2＜0.95，与一级反应相关性较差，见图 1（b）。健康受试者即样品 3 中， 当 PBMC 细胞浓度≥500 个/μL时，线性相关系数R2＞0.95，显示该体系较好地符合一级反应， 当 PBMC 细胞浓度为≤250 个/μL 时，R2＜0.95，与一级反应相关性较差。 为同时满足对健康受试者及 RA 患者 PBMC 中 LMP7 酶活力的检测，PBMC 细胞浓度应≥500 个/μL。

表1 PBMC 细胞浓度对LMP7 酶活力的影响

2.2 细胞冻融循环次数的优化

考察PBMC 细胞裂解时冻融循环次数对LMP7酶活力检测结果的影响，见图2。

结果表明，细胞冷冻循环次数对LMP7 酶活力检测有较大影响。 一次冻融即可充分裂解细胞，满足对PBMC 中 LMP7 酶活力的检测。 当 PBMC 细胞裂解冻融循环为1～2 次时，LMP7 酶活力不受冻融循环次数影响，差异无统计学意义(P＞0.05)。随着冻融循环次数的增加，LMP7 酶活力逐渐降低， 差异有统计学意义(P＜0.05)，冻融循环对LMP7 酶活力具有破坏作用，应尽量避免反复冻融。因此，在满足实验要求的前提下，为了进一步保护LMP7 酶活力及简化实验流程，选择对PBMC 细胞进行一次冻融以达到裂解细胞的目的。

图2 不同冻融循环次数下LMP7 的酶活力

2.3 PBMC 细胞冻存时间对LMP7 酶活力的影响

PBMC 细胞在液氮冻存不同时间之后的LMP7 酶活力，见图3。 结果表明，在使用液氮冻存细胞10 min到21 d 内，LMP7 酶活力无显著改变， 差异无统计学意义(P＞0.05)。 PBMC 细胞冻存 14 d 时，LMP7 酶活力较7 d 时略有下降，但差异无统计学意义(P=0.060)。 28 d时，LMP7 酶活力进一步减弱，较 1 d，3 d，7 d，14 d，21 d 均有差异有统计学意义(P＜0.05)。由此可见，使用液氮冻存PBMC 细胞， 可较好的保护LMP7 的酶活力，短时间冻存（＜21 d）对 LMP7 酶活力影响较小。 为确保实验结果，应尽量缩短冻存时间（不超过21 d，7 d 内最佳）， 在PBMC 细胞提取、 冷冻后及时进行检测。

图3 PBMC 细胞冻存时间对LMP7 酶活力的影响

3 讨论

酶活力指酶的催化活性，用规定反应条件下单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来表示。当底物浓度远远大于酶浓度时，Vmax 与酶的浓度成正比。该研究利用多肽荧光底物Ac-ANW-AMC，采用动态法，连续检测并计算单位时间内荧光产物AMC 的产生速度Vmax 来考察LMP7 酶活力。

饶文兵等通过极差分析得出酶浓度对酶活力测定的影响最显著[9-10]。 Koroleva ON 等[7]得出 LMP7 酶活性 in vitro 测定的最优化条件为：37℃，pH 8.0 的Tris-HCl 50 mM，NaCl 150 mM，Glycerol 10% ，SDS 0.01% (w/v)缓冲液，酶浓度0.2 nM，底物浓度20 μM。根据前期 Western blotting 实验， 每 106 个 PBMC 中LMP7（MW=27 kDa）含量约为 23～75 ng，该研究使用100 μlPBMC 细胞， 实验浓度区间为 125～1 000 个/μl。研究结果显示不同PBMC 细胞浓度即酶浓度下，LMP7 酶活力差异显著， 无论是健康受试者还是RA患者，当 PBMC 细胞浓度达到 500 个/μl 以上时，线性判定系数R2均＞0.95，符合一级动力学方程Vmax=k3[E]，能够更准确地反应酶活力。

Villoutreix BO 等[8]指出免疫蛋白酶体活性部位较不稳定，其活性受温度、pH 及例如Triton-100 等化学物质影响， 即使-80℃低温冻存其活性依然会随时间降低。 根据分子克隆实验指南[11]，该研究采用相对温和的反复冻融法以释放细胞中的蛋白质。使用液氮提高冻融速率，并在冻存时将PBMC 细胞悬液浓度提高为 5×106个/mL， 以尽可能地保护细胞及 LMP7 的酶活力。 为进一步优化裂解效果，对细胞冷冻保存时间和反复冻融法裂解对LMP7 酶活力的影响进行考察。研究结果表明经过3 次以上的冻融和21 d 以上的冻存对LMP7 酶活力的影响大，应在细胞提取后使用液氮冻融1 次后及时进行检测。

泛素-蛋白酶体系统是一种高效、 特异的蛋白质降解系统，是真核细胞中非溶酶体通路蛋白质降解的主要途径。 通过降解细胞内无用的、合成错误或受损的蛋白质来维持细胞内蛋白质的动态平衡，也因此参与调控生物体内几乎所有生命活动：调节转录、细胞生长周期、细胞分化和凋亡、细胞应激反应等[3]。

蛋白酶体26S 中的3 种β 亚基具有蛋白水解活性：β1（酸后水解活性）、β2（类胰蛋白酶活性）和 β5(类糜蛋白酶活性)在血源性细胞，尤其是淋巴细胞和单核细胞中，蛋白酶体包含活性部位的3 个亚基分别被LMP2（β1i）、MECL1（β2i）和 LMP7（β5i）替代，组成免疫蛋白酶体，其底物特异性发生了变化。 免疫蛋白酶体亚基直接参与了抗体呈递等免疫系统的运作，并在其中扮演关键角色[2-4]。

LMP7 在类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发生发展中发挥着重要作用[12]。 PR-957 是免疫蛋白酶体的共价性抑制剂，它选择性地抑制免疫蛋白酶体亚基LMP7。 使用PR-957 处理RA 细胞模型可抑制IL-23、TNF-α 和 IL-6 等细胞因子的表达。 使用 PR-957 处理CAIA 类风湿性关节炎小鼠模型， 首次用药24 h 后即可观察到病情缓解，用药7 d 后IL-1β、IL-6等炎性因子显著降低，小鼠跗骨关节炎症侵蚀和持续性的骨质溶解显著降低[6]。揭示免疫蛋白酶体与RA 存在一定联系，其表达、活性极有可能参与了RA 的发生、发展。该研究也证实，免疫蛋白酶体亚基LMP7 无论在健康人还是类风湿性关节炎患者的PBMC 中均有分布，且具有一定活性。RA 患者PBMC 中LMP7 活性高于健康受试者。通过大样本量研究对比健康人与RA 患者PBMC 中LMP7 的表达及活性， 有助于进一步研究LMP7 在RA 发生发展中的作用及机制，为抑制免疫蛋白酶体治疗自身免疫性疾病提供科学依据。

该研究发现样本中健康受试者LMP7 活性远远低于RA 患者，提示LMP7 与RA 存在明显相关性。但由于样本量小， 不同个体样本中LMP7 活性差异较大，为了得到准确的结论，仍需继续进行大样本采集检测分析。

该研究确定了LMP7 酶活力检测的最优条件，提供了一套简便、实用、可靠的LMP7 酶活力检测方法，对RA 等免疫性疾病中LMP7 酶的后续研究有重要意义。