木质素与酶的作用机制及其在纤维素酶水解中的影响研究进展

黄丽菁，吴彩文，邹春阳，闫雪晴，吴文娟

(南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210037)

目前，全世界的能源消耗主要来自于煤炭、石油、天然气等传统化石能源，社会经济的飞速发展使得人们对能源的需求不断增加，这将导致传统的化石燃料日益枯竭，也会带来严重的环境污染问题[1]，为了解决能源供求问题，开发可再生的清洁能源已成为必然趋势，这也将是人类社会可持续发展的重大挑战。

木质纤维原料是目前资源最为丰富、分布最为广泛的生物质，主要包括木材(阔叶材和针叶材)、能源植物(竹子、高粱等)、农业生产或林业加工废弃物(如棕榈树干、棉茧壳、橄榄壳、玉米秸秆等)[2]，具有可再生、储量大、价格低等优势，可转化为乙醇、氢气、生物柴油等生物质燃料[3]。其中生物乙醇的生产是通过酶水解纤维原料中的纤维素、半纤维素并发酵而成的，这种生产过程取决于3个关键步骤，包括预处理、酶水解以及将释放的糖进行发酵[4]，而预处理作为其中的关键环节对后续的酶水解有着重要的影响。

在木质纤维原料的处理过程中，木质素的存在使得木质纤维原料对纤维素酶水解具有顽抗性，导致细胞壁的3个主要成分(木质素、纤维素和半纤维素)难以有效的解离，从而导致酶水解效率的降低[5]。因此，研究木质素的结构特点有助于降低纤维原料的顽抗性，实现更高效的酶水解，也为开发经济高效的新型预处理技术提供了方法和技术支撑[5-6]。

目前，关于木质素对酶水解影响的研究有很多，但由于木质素结构的复杂多样性以及预处理对木质素结构的改变使得难以获得统一而确定的木质素对纤维素酶无效吸附的机理[7]。本文拟对纤维素酶水解的影响因素进行介绍，并综述木质素与酶之间的作用机理及其在纤维素酶水解中的影响研究进展。

1 木质纤维原料

1.1 组成与结构

木质纤维原料主要含有纤维素、半纤维素、木质素等，木质纤维原料来源不同，组成含量也不同[8]。通常，木质纤维素原料中纤维素、半纤维素和木质素的含量分别在30%～60%、20%～40%和15%～25%[9]。

纤维素是由葡萄糖组成的多糖聚合物，通过β-1-4糖苷键紧密连接，其聚合度在500～10 000。由于纤维素分子间的氢键作用，纤维素分为结晶区和无定形区，结晶区氢键排列规则紧密，无定形区氢键排列松散且没有规则。分子间的氢键连接是具有不同取向性的，因此产生了不同程度的结晶度。结晶度在纤维素的生物降解过程中起着至关重要的作用，一般来说，结晶度越高，纤维素的生物降解就越困难[10]。

半纤维素是由2种及以上的糖基组成，往往带有不同数量的支链或侧链。木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖等是组成半纤维素的主要糖基，它们根据半纤维素的来源以不同的比例排列。针叶材中的半纤维素以己聚糖为主，阔叶材中的半纤维素以戊聚糖为主。半纤维素分子量低，具有无定形区，比纤维素更易溶解，也更易受到化学攻击[11]。

木质素广泛存在于维管植物中，是由苯丙烷单元通过化学键连接而成的芳香族聚合物，作为粘合剂存在于胞间层与微纤丝之间，从而增强了细胞壁的结构[12]。构成木质素的结构单元主要有对-羟苯基结构(H)、愈创木基结构(G)和紫丁香基结构(S)3种，但不同来源的木质素结构差异有很大不同。这3种结构单元如图1所示。

图1 木质素3种结构单元[13]

一般来说，针叶木木质素含有丰富的G结构单元，阔叶木木质素同时包含G型和S型2种结构单元，而禾草类木质素则由G、S、H这3种结构单元构成[14]。因此根据所含结构单元的不同，木质素可进一步分为G型(针叶木木质素)、G-S型(阔叶木木质素)、G-S-H型(禾本科木质素)、G-H型(应压木木质素)[15]。表1为3种结构单元在不同种类植物中的含量[16]。

表1 不同种类植物中的木质素结构单元含量

1.2 木质素的来源与应用

木质素的分离方式一般有2种：1)溶出木质素，木质素降解为可溶性碎片从原料中分离出来；2)保留木质素，纤维素、半纤维素降解溶出，木质素作为固体残渣被保留下来[17]。根据分离方法的不同，木质素可分为磨木木质素(Milled Wood Lignin，MWL)、碱木质素、酶解木质素、木质素磺酸盐等。

磨木木质素又称Bjökman木质素[18]。磨木木质素是使用中性溶剂在无酸、无热的条件下进行提取。此方法的得率较低，但其化学结构未受到严重的破坏，与原木质素具有最相似的结构，经常被用于木质素化学结构的研究。

碱木质素是烧碱法或硫酸盐法化学制浆的副产物[19]，往往含有大量的小分子糖、提取物和无机盐等杂质，因此常用碱溶酸析法进行提纯[20]。经过提纯改性后的碱木质素可用于复合材料、橡胶等领域。

酶解木质素源自于生物乙醇的生产过程中的酶解残渣，通过有机溶剂或碱溶酸析法分离提取获得。它的结构与磨木木质素相似，但得率更高。由于酶解木质素未经过高温高压及酸碱的处理，保留了良好的天然结构，含有丰富的酚羟基，可作为在酚醛树脂中苯酚的替代物[21]。

木质素磺酸盐来源于亚硫酸盐制浆工艺。它能够溶解于一定pH的水溶液中，却不溶于大多数溶剂[22]。木质素磺酸盐具有良好的分散性和表面活性，可以被用作混凝土外加剂、染料分散剂，以及用于工业废水中重金属吸附的乳化剂和螯合剂[23]等。

2 木质纤维原料的预处理

木质纤维素结构复杂，纤维素周围被半纤维素和木质素形成的紧密的空间网状结构包裹。这种物理屏蔽阻碍了纤维素与外界的接触，也阻碍了纤维素的酶降解。为了增大原料的比表面积和提高酶对底物的可及性，改善纤维素的酶解效率，选择适当的预处理方式是必不可少的方法。一方面，可以破坏木质素和纤维素、半纤维素之间的连接，减少木质纤维素的顽抗性[24-25]；另一方面，在一定程度上破坏了纤维素结晶度，增加原料的孔隙度和比表面积，改善了纤维素对酶的可及性[26]。

目前，常用的木质纤维素预处理的方法有物理预处理，如机械粉碎法[27]、微波法[28]等方法；化学预处理，如酸法[29]、碱法[30]、有机溶剂法[31-32]、离子液体[33-34]等；物理化学预处理，如氨纤维爆破预处理[30]、蒸汽爆破预处理[35]等；生物预处理，如微生物预处理等[36-38]。每种方法都有其优缺点，可根据实际生产情况进行选择。

3 纤维素酶水解的影响因素

在木质纤维素原料酶水解中，影响纤维素酶水解的因素有很多，包括纤维素酶和酶水解条件、酶的可及性、底物对纤维素的包覆等因素。纤维素酶是能够将纤维素降解为葡萄糖的酶的总称，分为内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶β[39]。在一定的纤维素酶浓度范围内，酶解效率会随着纤维素酶浓度的增加而提高。T.Kinnarinen等[40]在研究磨碎的废弃硬纸箱的酶解过程中发现纤维素酶的浓度在很大程度上决定着还原糖的产率，但酶的用量也不是越多越好，当浓度达到一定程度时，水解速度的增加会变得缓慢。

当纤维素酶的浓度适宜时，其催化反应还需要在合适的温度以及pH值范围内进行。Jon等[41]在模拟温度、酶和生物量负荷对糖产量影响时发现，在较低的温度和较低的酶负荷下纤维素更易转化为葡萄糖。通常情况下，纤维素酶水解最适宜的温度在40℃～60℃。pH值最适宜的范围在4.5～5.5。但也有研究表明[42]，pH值>5.5会促进木质纤维素的酶解效率。

底物对纤维素酶水解也有着重要的影响，主要体现在纤维素的结晶度、纤维素可及比表面积以及木质素和半纤维素的空间阻碍等方面。在水解过程中纤维素酶首先水解纤维素中较易接近的无定形区，有研究表明[43]，破坏纤维素的晶体结构可增加其可及度从而加速纤维素的水解。酶对纤维素吸附量的大小往往由可及比表面积的大小决定，当底物的孔隙足够大时，通过纤维素酶系统的协同作用，可显著提高纤维素酶水解的效率[30]。增加可及比表面积还可以通过去除半纤维素和木质素的方式来增加木质纤维素原料的孔径和可及比表面积，减少酶的非生产性吸附，提高木质纤维原料的酶水解效率[44]。

3.1 木质素—酶相互作用的机制

许多研究表明，木质素对木质纤维原料的酶水解有着显著的抑制作用。尽管研究者已经对木质素和水解酶之间的相互作用做了大量的工作，但对这些相互作用背后的机制仍然不够清楚。目前认为酶水解中木质素的抑制作用主要来源于：1)木质素引起的非生产性吸附；2)木质素的空间结构[45]。

3.1.1 非生产性吸附 纤维素酶和木质素之间的非生产性吸附主要与疏水作用[46]、静电作用[47]、氢键作用[48]有关。

3.1.1.1 疏水作用 疏水作用指的是酶结构中的芳香性氨基酸的残基与木质素表面疏水基团的结合。纤维素酶中碳水化合物结合域和木质素之间的疏水作用被认为是纤维素酶催化木质素非生产性结合的主要原因。除了碳水化合物结合域以外，纤维素酶催化域上的疏水区域也被认为会导致对木质素的吸附[49]。K.T.Hodgson等[50]测量了木质素和纤维素的接触角，发现木质素的接触角大于纤维素的接触角，说明木质素的疏水性高于纤维素，当木质素与纤维素同时存在时，纤维素酶会优先吸附木质素。

3.1.1.2 静电作用 虽然疏水作用是主要的驱动力，但静电作用对蛋白质在固体表面的吸附行为也起着重要的作用。水相环境中官能团(如木质素的羧基、羟基、酶的氨基酸残基)的缔合、解离会使木质素和酶产生表面电荷，从而引起它们之间的静电相互作用[51-52]。在水溶液中，木质素的基团(羟基和羧基)会发生电离使其表面带有负电；而纤维素酶表面有许多暴露在外的氨基酸残基，这是一种两性基团，它所带的电荷性质会随着pH条件的变化而改变[45]。例如，当等电点一定时，β-葡萄糖苷酶在pH<5.5时带正电，几乎完全吸附带负电的木质素；而当pH值增加到6.0时，β-葡萄糖苷酶对木质素的吸附能力显著降低。但对于外切型葡聚糖酶和内切型葡聚糖酶来说，pH的变化对木质素-酶相互作用的影响并不明显，因为这2种酶的等电点均<5.0，并且在其应用pH值范围5.0～6.0显示出负电荷[53]。

3.1.1.3 氢键作用 氢键作用是通过木质素和酶中的羟基发生的，在这些基团中，酚羟基直接负责酶的吸附，而脂肪族和羧基羟基被认为有助于木质素-酶的离子相互作用[54]。目前对木质素与纤维素酶之间的氢键结合的研究较少，因此需要进一步研究氢键对木质素-酶相互作用的影响。

3.1.2 空间位阻 除了酶的非生产性吸附外，木质素还可以通过空间位阻来抑制纤维素水解。在木质纤维原料预处理的过程中，木质素可以迁移到纤维表面，导致整个生物量基质重新分布；也可以通过溶解的木质素重新凝聚形成液滴沉积在纤维素表面，阻碍酶在纤维表面的吸附，进一步抑制纤维素的水解[46]。J.K.Ko等[55]在高温液态水预处理混合阔叶木的过程中，用电镜扫描观察了在细胞壁表面形成的球形液滴，发现这些液滴主要是疏水性的木质素，它们沉积在纤维素表面阻碍了水解，直观地解释了空间位阻对纤维素酶水解的影响。

3.2 木质素结构单元对纤维素酶水解的影响

木质素结构单元的差异，直接影响木质素的分子结构，是木质素大分子结构差异的最主要的因素。木质素的组成因素对酶解过程中有着显著影响，被认为是酶水解的障碍，而在组成因素中，S/G比是研究最多的因素之一。S/G比之所以能影响酶水解，是因为它会影响木质素交联，进而影响植物细胞壁的三维结构和酶的纤维素可及性。

许多研究者发现，S/G比与酶对木质素的吸附量呈负相关，但与纤维素水解产量呈正相关。例如，M.H.Studer等[56]在对杨树样本研究的过程中发现，较高的S/G比意味着较高的脱木素率，由于高S/G比的木质素中不稳定的β-O-4键所占比例较高，导致它更容易进行预处理。因此在这种情况下，木质素更易水解。J.K.Ko等[53]经过研究发现,G单元含量高的木质素能吸附更多的纤维素酶，尤其是β-葡萄糖苷酶，木质素对β-葡萄糖苷酶的吸附间接抑制了阔叶木中纤维素的酶解，表明木质素的S/G比在纤维素酶吸附木质素和生物质水解中的重要性。J.E.Kim等[57]研究了在相同反应条件下，草酸和硫酸催化剂对稀酸预处理生物质中木质素结构变化的影响。实验中发现，在草酸预处理的生物质中，由于G型木质素的含量较高，导致其对酶解效率有负面的影响。在比较酶在马尾松木质素膜与麦草、杨木木质素膜上的吸附量时，发现酶在马尾松木质素膜上的吸附量更高。而马尾松、麦草、杨木的S/G比分别为0、0.5、1.47，因此这一结果可以证明G单元含量越高，吸附量越大[58]。

然而，关于S/G比对于纤维素酶水解的影响还存着一些不同的结论。一些研究发现，S/G比与未经处理的木质纤维原料的酶水解呈负相关。在磨木木质素对纤维素酶的吸附实验中，L.P.Tan等[59]发现经过酸性亚硫酸盐预处理的磨木木质素显示出更高的S/G比以及更高的酶吸附能力。在研究桉树3个突变体及相应野生型在离子液体预处理前后对纤维素水解能力的影响时，G.Papa等[60]发现，高S/G比木质素会导致葡萄糖产率降低(r=0.97；P<0.03；n=4)，但不影响离子液体预处理后的葡萄糖产率。这是由于离子液体预处理的高效性掩盖了S/G比值改变的影响。也有一些研究表明，生物原料的水解能力不受S/G比的影响。为了研究S/G比对苜蓿酶促水解的影响，B.S.Dien等[61]创建了转基因苜蓿，这种苜蓿的S单位含量低于野生型苜蓿，经过实验未发现S/G比对经过稀酸预处理的苜蓿的酶水解有显着影响。N.A.Tobimatsu等[62]培育出了G、S、H单元含量较高的木质素，经过实验发现，G、S单元的含量对纤维素酶水解的影响几乎为零，而H单元的增加对纤维素酶水解有促进作用，它所产生的葡萄糖几乎是从前的2倍，因此研究者认为，与G和S单元的含量相比，木质素结构中醛基的含量才是酶水解的决定性因素。

由于H单元在木材中的含量较少，对于H单元对纤维素酶水解的影响的研究较少。有数据表明，H单体可能与β-1-4-葡聚糖链而不是半纤维素连接，从而导致小麦和水稻中纤维素结晶度降低，因此H/G对水稻和小麦木质纤维素糖化有积极影响[63]。H单元之所以会产生积极作用，可能是因为木质素分子量降低、纤维素结晶度由于H单元与葡聚糖链的连接而降低或者是H单元的结合活性高于G、S单元[64]。F.F.Guo等[65]却在试验中发现木质素中H单元的浓度可能对吸附量没有影响。松木木质素和白杨木质素几乎含有相等的H单元，松木木质素的吸附量大于白杨木质素。秸秆木质素比松木木质素具有更多的H单元和较弱的亲和力，红麻木质素比白杨木质素和松木木质素具有更多的H单元和较弱的吸附能力，说明H单元数量的增加并没有增加吸附能力。秸秆木质素比红麻木质素具有更多的H单元和更大的亲和力，说明H单元数量的增加也没有降低亲和力。这些结果表明，H单元的数量可能与吸附能力无关。

4 展望

酶水解是利用木质纤维原料生产生物乙醇的重要途径，而木质素通常被认为对木质纤维原料的酶水解有着显著的抑制作用。近年来，随着各种技术的综合利用以及新技术的开发，针对木质素对纤维素酶水解的影响的研究越来越多。在木质素对酶水解或酶吸附的研究中，由于木质素结构不同的底物，其生物构造、化学组分的构成、分子结构和超分子聚集态等也各不相同，传统的研究方法通常只能间接推测木质素对酶的吸附及对底物酶水解的影响。这也是目前对木质素结构如何影响酶水解存在不同观点的重要原因。如何消除非木质素因素的干扰，是解决这一难题的关键所在。未来的工作可以考虑制备具有不同单元构成的木质素样品，运用先进的技术，如耗散型石英晶体微分析天平，进行原位、实时研究不同结构单元的木质素，以及纤维素复合物在酶吸附和/或酶水解动态行为，在排除其他干扰因素(即除木质素结构不同，其他条件完全相同)的条件下，深刻认识木质素单一因素的影响，构建木质素结构单元与纤维素酶吸附及其对酶水解糖转化的“构-效”关系，为改进现有预处理方法及开发新的高效的预处理方法提供理论依据和技术支持，并有助于提高木质纤维素的酶解效率，实现以木质纤维素为原料进行生物乙醇高效转化的工业化生产。