大黄鱼小清蛋白提取工艺优化及免疫印迹分析

吕春霞 杨留明 陈世达 张慧恩 杨 华

(浙江万里学院，浙江 宁波 315100)

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)，硬骨鱼纲鲈形目石首鱼科黄鱼属[1]，俗称黄花鱼、桂花鱼等，是中国近海主要的经济鱼类[2]。但是其含有致敏原小清蛋白，可对人体产生过敏反应。

水产食物的主要过敏原多属糖蛋白，其热稳定性较高，分子量为10～70 kD，如小清蛋白、原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌钙结合蛋白等[3]。小清蛋白(parvalbumin, PV)是多数鱼类中确定的主要过敏原[4-6]，其中大部分为硬骨鱼类。研究表明，鳕鱼过敏原中的4个抗原亚组分中，pI 4.75的过敏原M即为PV[7-8]，是鳕鱼的主要过敏原[9]。Kobayashi等[10-11]在沙丁鱼、马鲛鱼、红绸鱼及太平洋鲭等鱼类的白色肌肉组织中发现了含量丰富的PV，其深色肌肉组织中也有较低浓度的PV。

小清蛋白是稳定性较高的蛋白，对酸碱度、温度和各种变性剂都有很强的耐受性，由于小清蛋白分子构象、折叠能力和抗原表位的不同及特殊性，其在酶解和高温条件下均很稳定，并仍具有过敏性[12-13]。蛋白质会受到游离基作用发生氧化，从而改变其蛋白功能特性[14]6-7，而脂质过氧化反应产生的自由基迁移可诱导蛋白质聚集。目前国内外有关小清蛋白的研究[15-16]较多，而关于大黄鱼小清蛋白的研究较少，吴玟静等[17]以阿拉斯加狭鳕、蓝点马鲛、大黄鱼等7种鱼为原料，证明了鱼类过敏原主要为48～57，33～41，28，17 kU的蛋白，并通过间接ELISA和抑制性ELISA证实了不同鱼类蛋白之间存在强烈的交叉反应。目前由过敏原直接引起的过敏性疾病呈大幅增加趋势[18]。试验拟先对大黄鱼小清蛋白的提取工艺进行优化，并对其进行免疫印迹试验，以期为后续大黄鱼小清蛋白的理化特性及致敏机理的确定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

大黄鱼：市售；

改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

十二烷基磺酸钠(SDS)、10% SDS、1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.8)、1.0 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=6.8)、30%丙烯酰胺(29∶1)、5×SDS-PAGE上样缓冲液、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(AP)、甘氨酸(Gly)、羟甲基氨基甲烷(Tris)、二硫苏糖醇(DTT)、考马斯亮蓝R-250、考马斯亮蓝G-250：分析纯，北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司；

吐温20：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

鼠抗蛙小清蛋白单克隆抗体PARV-19：美国Sigma公司；

鲑鱼小清蛋白标准品：江苏酶标生物科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：PL2002型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

pH计：FE20型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

双室真空包装机：DZ-400型，宁波江东明兴包装设备物资有限公司；

恒温水浴锅：DK-8D型，上海维诚仪器有限公司；

垂直电泳仪：DYY-6C型，北京六一生物科技有限公司；

酶标仪：Multiskan FC型，美国Thermo公司；

漩涡混匀器：XW-80A型，西宝生物科技有限公司；

冷冻干燥仪：ALPHA2-4型，上海实维实验仪器技术有限公司；

高速冷冻离心机：Avanti J-26XP型，美国贝克曼库尔特；

三清超微粉碎机：SQW-6DI型，山东三清不锈钢设备有限公司；

1.2 方法

1.2.1 样品处理 养殖大黄鱼去头后以背鳍线下刀，将鱼肉体与主骨、脂肪层和内脏分开，尖刀剔离鱼皮，拔出鱼刺，冰水洗净，超微粉碎机搅碎，真空包装，-40 ℃冻藏。

1.2.2 脱脂处理 参照夏珊珊等[19-21]的方法并修改。以预处理鱼糜为原料，选取正丁醇、乙酸乙酯、氯仿+甲醇(V氯仿∶V甲醇=1∶1)、异丙醇、乙醚+乙醇(V乙醚∶V乙醇=1∶1)、40 g/L Na2CO3溶液作脱脂剂，料液比(m大黄鱼∶V提取液)1∶10 (g/mL)，提取温度20 ℃，提取时间24 h，并以预处理鱼糜为对照组。测定其脂肪含量和总蛋白浓度，计算脱脂后各组脂肪质量分数及蛋白浓度，选择最佳脱脂溶剂。

1.2.3 脂肪含量测定 按GB 5009.6—2016执行。并按式(1)计算样品(干基)脂肪质量分数。

(1)

式中：

X——样品中脂肪质量分数，%；

m1——恒重后接收瓶和脂肪的质量，g；

m0——接收瓶质量，g；

m2——样品干重质量，g。

1.2.4 蛋白浓度测定 采用Bradford法。

1.2.5 小清蛋白粗提取 根据陆宗超[14]27的方法并略作修改。准确称取鱼糜(1.00±0.01) g，与50 mmol/L、pH 7.0 的Tris-HCl缓冲液以料液比(m大黄鱼∶V提取液)1∶40 (g/mL)混匀，30 ℃下浸提42 h，4 ℃、8 500 r/min离心15 min，取上清液即得大黄鱼肌浆蛋白溶液。肌浆蛋白于沸水中水浴40 min，8 500 r/min离心15 min，上清即为小清蛋白粗提物。上清中加入75% (NH4)2SO4静置2 h，待析出絮状物后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取沉淀以0.02 mol/L Tris-HCl复溶，透析脱盐，得小清蛋白粗提物。

1.2.6 小清蛋白提取液选择 选用50 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.5)、50 mmol/L Tris-HCl—50 mmol/L Gly—1 mmol/L DTT(pH 7.5)和50 mmol/L Tri-HCl—50 mmol/L Gly (pH 7.5)溶液，以1 mol/L KCl溶液作为高浓度提取液的对比，提取方法参照1.2.5。

1.2.7 单因素试验

(1) 提取液浓度：准确称取鱼糜1.00 g，脱脂，固定提取液pH 7.0、料液比(m大黄鱼∶V提取液)1∶40 (g/mL)、提取温度30 ℃、提取时间42 h,考察提取液浓度(20，35，50，65，80，95 mmol/L)对大黄鱼小清蛋白得率的影响。

(2) 提取液pH：准确称取鱼糜1.00 g，脱脂，固定提取液浓度50 mmol/L、料液比(m大黄鱼∶V提取液)1∶40 (g/mL)、提取温度30 ℃、提取时间42 h，考察提取液pH(3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)对大黄鱼小清蛋白得率的影响。

(3) 料液比：准确称取鱼糜1.00 g，脱脂，固定提取液浓度50 mmol/L、提取液pH 7.0、提取温度30 ℃、提取时间42 h，考察料液比(m大黄鱼∶V提取液)[1∶40，1∶60，1∶80，1∶100，1∶120，1∶140，1∶160，1∶180，1∶200 (g/mL)]对大黄鱼小清蛋白得率的影响。

(4) 提取温度：准确称取鱼糜1.00 g，脱脂，固定提取液浓度50 mmol/L、提取液pH 7.0、料液比(m大黄鱼∶V提取液)1∶40 (g/mL)、提取时间42 h，考察提取温度(10，20，30，40，50，60 ℃)对大黄鱼小清蛋白得率的影响。

(5) 提取时间：准确称取鱼糜1.00 g，脱脂，固定提取液浓度50 mmol/L、提取液pH 7.0、料液比(m大黄鱼∶V提取液)1∶40 (g/mL)、提取温度30 ℃，考察提取时间(10，18，26，34，42，50，58，66，74，84 h)对大黄鱼小清蛋白得率的影响。

1.2.8 小清蛋白得率测定 按式(2)计算小清蛋白得率。

(2)

式中：

X——小清蛋白得率，%；

m0——分离纯化后样品质量，g；

m——鱼糜质量，g。

1.2.9 响应面试验 参照李晓等[22-23]的方法，在单因素试验基础上，采用Design Expert v8中的Box-Behnken设计原理进行四因素三水平响应面试验设计，考察提取液浓度、提取液pH、料液比、提取温度4个因素对小清蛋白得率的影响。

1.2.10 阴离子柱层析纯化小清蛋白粗提物 参照刘光明等[24]的方法并修改。采用HiPrepTM(16/10)DEAE FF阴离子柱GE层析系统进一步纯化小清蛋白粗提物。控制系统为KTA pure LI protein purification system(GE Healthcare Uppsala Sweden)系统；洗脱A液为pH 7.5，0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液；洗脱B液为pH 7.5，0.5 mol/L NaCl—0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液。每2 mL收集一次，测定洗脱液在220，280 nm处吸光值。收集的目的蛋白溶液用HiPrepTM(26/10)Desalting柱脱盐，冷冻干燥，冻干粉-40 ℃贮藏。

1.2.11 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 采用Ulrich[25]的方法制备1.5 mm不连续SDS-PAGE凝胶，根据小清蛋白的分子量选择配制15%分离胶，5%浓缩胶，采用60 V恒压进行浓缩胶的电泳，90 V恒压进行分离胶的电泳。结束后取出凝胶，考马斯亮蓝R-250染色2 h，脱色至胶片背景清晰，凝胶成像。

1.2.12 免疫印迹分析 参照Kanna等[26-27]的方法，采用免疫印迹检测大黄鱼小清蛋白过敏原的免疫活性。SDS-PAGE凝胶电泳后，进行免疫印迹试验。

1.3 数据处理

除阴离子柱层析曲线外，所有试验均重复3次，结果以Mean±SD表示。采用IBM SPSS Statistics 25软件进行数据分析，组间差异比较采用One-way ANOVA分析，两两比较采用Tukey法分析均值的差异显著性，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。数据统计均采用GraphPad prism 7.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 脱脂条件优化

由图1、2可知，与对照组相比，正丁醇、乙酸乙酯、氯仿+甲醇、异丙醇、乙醚+乙醇、Na2CO3组脱脂效果显著(P<0.05)；正丁醇、氯仿+甲醇、异丙醇组的蛋白浓度较接近(P<0.05)，表明这3种脱脂方法蛋白损失率较低，且脱脂后10 kDa的小清蛋白灰度接近于对照组，故选择正丁醇进行脱脂处理。

2.2 大黄鱼小清蛋白粗提取

由图3可知，Tris-HCl-Gly-DTT、Tris-HCl-Gly、PBS、KCl组的蛋白质量浓度分别为433.59，402.20，391.78，374.03 μg/mL，且差异显著(P<0.05)。

由图4 可知，高浓度溶液对10 kDa蛋白浓度的提取效果较差，反而会增加杂蛋白浓度，由于加入还原剂DTT可以减少小清蛋白的氧化，提高抽提蛋白的含量和免疫活性[14]13-15，使加入DDT的提取液杂蛋白条带较少，所以选用Tris-HCl-Gly-DTT作为提取液。

2.3 单因素试验

由图5可知，提取液浓度对小清蛋白得率影响较为明显，当Tris-HCl缓冲液浓度为20～95 mmol/L时，小清蛋白得率随其浓度升高呈先升高后降低的趋势，当Tris-HCl缓冲液浓度为65 mmol/L时，小清蛋白得率最高。提取液pH对小清蛋白得率影响较为明显，当Tris-HCl缓冲液pH为3.5～10.0时，小清蛋白得率先上升后下降，当pH为6.0时，小清蛋白得率达最高；当pH为3.5时，小清蛋白得率接近于0，推测小清蛋白的pI为3.5，而Elsayed等[7-8]研究发现鳕鱼过敏原M(PV)的pI为4.75，略高于试验测定值。当料液比(m大黄鱼∶V提取液)为1∶40～1∶140 (g/mL)时，小清蛋白得率先升高后降低，当料液比(m大黄鱼∶V提取液)为1∶120 (g/mL) 时，小清蛋白得率达最高。当提取温度为10～60 ℃时，随着提取温度的升高，小清蛋白得率先升高后降低，当提取温度为20 ℃时，小清蛋白得率达最高。由于提取温度升高，分子运动速度加快，在不破坏蛋白结构的前提下提高了蛋白溶出率，但当提取温度>20 ℃时，继续升高提取温度，蛋白质的空间构象发生变化且在一定程度上发生变性沉淀，蛋白质溶出量减少，得率下降[28]。当提取时间为42 h时，小清蛋白得率达较大后趋于平稳，故固定提取时间为42 h。

与对照组相比，* P<0.05，** P<0.01；与正丁醇组相比，# P<0.05，## P<0.01图1 脱脂方法对大黄鱼脂肪质量分数和蛋白质量浓度的影响Figure 1 Effects of different degreasing methods on fat content and protein concentration of Pseudosciaena crocea

1. Na2CO3组 2. 乙醚+乙醇组 3. 氯仿+甲醇组 4. 正丁醇组 5. 异丙醇组 6. 乙酸乙酯组 7. 对照组 M. Marker图2 大黄鱼脱脂后SDS-PAGE电泳图Figure 2 SDS-PAGE electrophoresis of the large yellow croaker protein extracts after degreasing

字母不同表示差异显著(P<0.05)图3 提取液种类对大黄鱼小清蛋白浓度的影响Figure 3 The effect of the type of extract on the concentration of parvalbumin from Pseudosciaena crocea

2.4 响应面试验

2.4.1 模型及显著性分析 在单因素试验基础上，以提取液浓度、提取液pH、料液比和提取温度为试验因素，以小清蛋白得率为评价指标，根据Box-Behnken设计原理进行四因素三水平响应面试验设计。响应面试验因素与水平表见表1，试验设计与结果见表2。

采用Design Expert v8软件对响应面试验结果进行多元回归拟合分析，得二次多项式回归方程：

M. Marke 1. PBS 2. Tris-HCl-Gly-DTT 3. Tris-HCl-Gly 4. KCl图4 大黄鱼小清蛋白粗提物SDS-PAGE电泳图Figure 4 SDS-PAGE electrophoresis of crude extract of parvalbumin from Pseudosciaena crocea

字母不同表示差异显著(P<0.05)图5 各因素对大黄鱼小清蛋白提取率的影响Figure 5 Effects of different extraction factors on the extraction rate of parvalbumin from Pseudosciaena crocea

Y=9.388 3×10-2+1.282 9×10-3A-4.850 1×10-2B+7.518 98×10-5C-3.337 15×10-4D-6.259 77×10-5AB+5.556 6×10-7AC+1.162 84×10-5AD+3.006 13×10-5BC+1.869 81×10-4BD+2.448 38×10-6CD-9.962 15×10-6A2+3.466 13×10-7B2-3.466 13×10-7C2-2.219 72×10-5D2。

(3)

表2 Box-Behnken试验设计与结果

由表3可知，失拟项P=0.399 1，不显著，表明该回归模型的预测值与实际值拟合较好。模型P<0.01，表明该模型极显著，试验方法准确可行。R2=92.41%，说明各因素存在线性相关，拟合程度良好，试验误差小。因此，可以采用该模型分析和预测不同条件下的提取率。各因素对小清蛋白得率的影响顺序为提取液浓度>提取温度>料液比>提取液pH。一次项B和C与二次项B2对小清蛋白得率影响极显著(P<0.01)，一次项D对小清蛋白得率影响显著(P<0.05)。

2.4.2 因素间的交互影响 各因素变量之间的交互作用对响应值——小清蛋白得率的响应面三维图如图6所示，其中提取液浓度和提取液pH、提取液浓度和提取温度、料液比与提取液pH、提取温度和提取液pH的交互作用响应面曲面坡度陡峭，说明其对大黄鱼小清蛋白得率影响显著。

2.4.3 最优工艺条件的确定及模型验证 通过响应面法得到大黄鱼小清蛋白的最优提取工艺为提取液浓度72 mmol/L、提取液pH 8.0、料液比(m大黄鱼∶V提取液)1∶180 (g/mL)、提取温度50 ℃，此条件下的小清蛋白得率为0.174 2%(n=3)，与理论预测值0.181 1%基本相符，说明该回归方程能真实反映各因素对小清蛋白得率的影响。孙妙[29]研究表明，大菱鲆鱼肉中的过敏原小清蛋白得率为0.286%，可能是因为鱼种不同。

表3 提取工艺回归模型方差分析表†

图6 各因素对小清蛋白得率的交互作用Figure 6 Response surface optimization map

2.5 大黄鱼小清蛋白粗提物阴离子柱层析纯化

试验表明，大黄鱼小清蛋白提取液在220 nm处的吸收峰远高于其他波长，这可能与小清蛋白缺少在280 nm处有吸光值的色氨酸有关[30]。故在220 nm下测定小清蛋白的洗脱曲线，共分离得到4个明显的洗脱组分(见图7)。

由图8可知，洗脱峰1、2的蛋白含量较高且成分单一，分子量约为10 kDa，与陆宗超[14]38报道的小清蛋白分子量相符。结合图7和图8可知，大黄鱼小清蛋白的最高盐浓度为0.5 mol/L，当盐浓度为0.16 mol/L时停止目的样品的收集。

2.6 小清蛋白的免疫印迹确认

小鼠抗蛙单克隆小清蛋白抗体PARV-19，是目前商用化的已被证实并被使用的单克隆抗体，已被用于确认鲤鱼、鲶鱼、鳕鱼和罗非鱼中的小清蛋白。由图9可知，纯化后的大黄鱼小清蛋白可在分子量10～12 kDa处与小鼠抗蛙单克隆抗体出现明显的特异杂交显色条带，据此判定纯化的蛋白样品即为小清蛋白。

图7 大黄鱼小清蛋白阴离子柱层析洗脱图Figure 7 Parvalbumin of Pseudosciaena crocea anion column chromatography elution map

3 结论

采用热肌浆蛋白热提取和阴离子柱层析的方法研究了养殖大黄鱼小清蛋白的提取工艺，此时的洗脱液盐浓度为0.16 mol/L。提取前进行脱脂处理，大大减少了其他杂质，提高了小清蛋白的纯度，而还原剂二硫苏糖醇的添加，减少了小清蛋白的氧化，提高了其提取得率。响应面优化确定的养殖大黄鱼小清蛋白最佳提取工艺条件为提取浓度72 mmol/L，提取液pH 8.0，料液比(m大黄鱼∶V提取液)1∶180 (g/mL)，提取温度50 ℃，提取时间42 h，此条件下小清蛋白得率为0.174 2%；采用免疫印迹法分析小清蛋白的分子量约为12 kDa。由于小清蛋白的分离纯化技术较为复杂，其致敏及脱敏机理有待进一步深入研究。

M. Marker A. 大黄鱼肌浆蛋白 B. 大黄鱼小清蛋白热提取物 1. 第1洗脱峰 2. 第2洗脱峰 3. 第3洗脱峰 4. 第4洗脱峰图8 大黄鱼小清蛋白阴离子柱层析SDS-PAGE电泳图Figure 8 SDS-PAGE electrophoresis of parvalbumin from Pseudosciaena crocea eluted by anion column chromatography

M. Marker 1. 纯化的小清蛋白图9 小清蛋白的免疫印迹分析Figure 9 Western-blot of parvalbumin