中药渣固态发酵前后蛋白质和多糖含量的变化

白 海，高 阳，刘丽敏，马 毅

（1.天津大学化工学院，天津 300072；2.山西大同大学生命科学学院，山西大同 037009；3.天津通和饲料有限公司博士后科研工作站，天津 301700；4.山西大同大学脑科学研究所，山西大同 037009；5 天津畜牧兽医研究所，天津 300112）

我国对传统中药的使用具有悠久的历史，且其种类繁多，资源丰富，并在最近的新型冠状病毒肺炎的治疗过程中发挥了重要作用[1]。随着我国中医药工业的不断发展，人们对中医药需求不断增加，如各类保健品、中成药等，致使中药废弃物也越来越多，由大型制药厂产生药渣约占总量70%，而中药渣主要是通过填埋、燃烧等方式进行处理，这样做会消耗大量的时间、人力，造成资源浪费、环境污染，这不仅为中医药产业的发展带来严峻挑战，也为生产厂家带来处理难题，更为生态环境的保护带来了诸多难题[2]。有研究表明，中药提取后，中药渣还含有一定功效成分，如蛋白质、多糖、氨基酸和微量元素等营养成分的存在，具有较高的营养价值和药用价值[3]。随着微生物技术和发酵工业的发展，以中药渣为原始材料，大规模地发酵生产具有功能性营养的饲料，不仅可以减少中药资源的浪费，减轻对环境造成的污染，而且可以解决饲料供应不足问题，同时这种新型饲料还可以增强动物对疾病的抵抗力、促进动物体内新陈代谢、改善动物生长性能等作用，是一项具有发展潜能的新技术。将其应用在饲料添加剂、兽药等方面，可实现中医药资源的再利用，为中药渣的综合利用提供一条新途径[4-5]。

本试验以枯草芽孢杆菌、黑曲霉、产朊假丝酵母菌作为发酵菌种，研究了3种菌种不同复配比例对中药渣固态发酵的影响，可为探究中药渣残留物制备饲料添加剂的工艺应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），产朊假丝酵母(Candida utilis)，黑曲霉（Aspergillus nige），购自中国普通微生物菌种保藏中心。

1.2 中药渣复合物

试验采用的中药渣复合物为治疗高血压的中药渣，经干燥粉碎后备用。该药渣主要由煎熬浸取后的茯苓、甘草、蒲公英等组成，测得其初始蛋白质含量为6.76%，多糖含量为8.83%。

1.3 固态发酵培养基

10 g 中药渣，20 g 琼脂，30 g 玉米粉，1 L 蒸馏水，初始pH 7.5，121 ℃灭菌20 min，用于混合菌种固态发酵试验。

1.4 试验仪器

电子天平JH1102(上海精科天美科学仪器有限公司），洁净工作台SW-CJ-2F(上海博迅实业有限公司医疗设备厂），生化培养箱SPX-100B-Z(上海博迅实业有限公司医疗设备厂），微波炉G70F20N2L-DG(广东格兰仕微波炉电器制造有限公司），立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-100SII(上海博迅超温保护压力蒸汽灭菌器），紫外/可见分光光度计UV-1200(上海美国谱达仪器有限公司），三孔三温恒温水浴锅XMTD-204(金坛市盛威试验仪器厂）。

1.5 试验方法

1.5.1 混合菌种间比例的确定

分别稀释3 种不同的菌，使菌悬液的浓度为1×108cfu/mL，将菌悬液按试验比例接种到培养基上，在37 ℃下静置培养一段时间，取出后用微波炉烘干，取0.1 g的样品融于10 mL蒸馏水中，测定发酵产物中的多糖和蛋白质含量，以选定最佳菌种配比。

1.5.2 固态发酵水平下单因子试验

分别测量在不同初始pH 值、初始玉米粉含量、发酵时间和菌液接种量下发酵产物中蛋白质和多糖含量变化，以确定最适条件。

1.5.3 发酵条件优化试验

选取发酵后产物中多糖和蛋白质的含量作为评价指标，选择与预试验相同的单因子进行试验，各取3个水平进行测量。

1.6 测定方法

1.6.1 多糖的测定

采用3,5-二硝基水扬酸法(简称DNS 法)测定多糖的含量[6]。

1.6.2 蛋白质的测定

采用考马斯亮蓝G-250 染色法测定蛋白质含量[7]。

2 结果与分析

2.1 不同菌种比例对发酵后蛋白质和多糖的影响

单一菌株的酶系统相对中药渣底物来说不完整，对发酵基质的转换有一定的限制，而不同菌种组合可以克服上述不利的因素。本试验使用多菌株的组合来协调发酵，并且期望每个菌株的酶系统通过彼此互补来增加蛋白质与多糖的产量。在该试验中，固态发酵培养基中分别接种了枯草芽孢杆菌：产朊假丝酵母菌：黑曲霉，其比例分别为1∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1、1∶2∶2、2∶1∶2、2∶2∶1，试验结果见图1所示。

由图1可知，当枯草芽孢杆菌∶产朊假丝酵母菌∶黑曲霉为1∶2∶1时，发酵后的蛋白质和多糖含量都是最小值；当比例为1∶2∶2、2∶1∶2 和2∶2∶1 时，蛋白质含量都十分接近，故不能单独作为参考指标，需结合多糖含量来确定最佳菌种比例。当比例为2∶1∶2时，蛋白质和多糖含量均达到最高，分别为4.23%和5.37%，所以选择发酵后蛋白质和多糖含量最高的一组进行后续试验。

图1 混合菌种不同比例对发酵产物蛋白质和多糖的影响

2.2 不同因素对发酵后蛋白质和多糖含量的影响

2.2.1 初始玉米粉含量对发酵后蛋白质和多糖含量的影响

细菌的生长和繁殖需要足够的营养物质，而氮源的含量在细菌的生长中起着重要的作用。本次试验以玉米粉为氮源，探究不同初始玉米粉含量对微生物生长和发酵的影响。图2 是发酵培养基初始玉米粉含量分别为0.1、20、30、40、50 mg/mL 时发酵后蛋白质与多糖的含量的测定结果。

图2 玉米粉含量对发酵后蛋白质和多糖含量的影响

由图2 可知，在固态发酵的过程中，适量的玉米粉含量可以为微生物提供足量的氮源，并且有利于微生物的发酵。玉米粉含量过少可导致氮源不足，不能使微生物正常的生长，从而影响其发酵效果，导致发酵后的蛋白质及多糖含量较低；玉米粉含量过多，可能会导致培养基水分不足，从而抑制微生物的生长代谢。当玉米粉含量达到30 mg/mL 时，微生物发酵后蛋白质和多糖的含量都达到最佳，分别为2.85%和0.41%。因此，选择添加30 mg/mL 玉米粉作为氮源进行后续试验。

2.2.2 初始pH值对发酵后蛋白质和多糖含量的影响

在微生物生长过程中，pH 值直接或间接的影响细菌的正常生长，其过高或过低都会影响生长速率，不利于发酵过程，培养基的初始pH 值与混合菌种的生长发酵有着直接的关系。

由图3 可以看出，在初始pH 值为7.5 时，微生物发酵后蛋白质与多糖的含量均达峰值，分别为6.74%和0.75%。大于或小于此pH 值时，发酵后蛋白质的含量均降低，在pH 值为6.5 时，多糖含量为0.72%，而蛋白含量仅为3.11%。

图3 初始pH值对发酵后蛋白质和多糖含量的影响

2.2.3 混合菌种接种量对发酵后蛋白质和多糖含量的影响

在发酵过程中，微生物的数目也是重要的一环。在最适的菌种配比下，菌种数目不足，会大大影响发酵的速率，浪费时间及材料，增加了不必要的成本；而菌种数目过多，又可能会增加微生物之间的竞争，造成培养基中的营养物质消耗太快，不利于其发酵过程。混合菌种初始接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%时发酵产物中蛋白质和多糖含量的变化如图4所示。

图4 接种量对发酵后蛋白质和多糖含量的影响

图4 表明了不同的接种量对发酵的影响。由图可知，随着接种量的增加，蛋白质含量呈现先降低再增加，到达最高后又出现的小幅的减少；多糖的含量一开始就出现不断增长的趋势，并在接种量为3%时达到最大，随后显著降低。只有当接种量为3%，发酵物中的蛋白质与多糖的含量都相对稳定，并可以取得良好的发酵结果。所以，选择初始接种量为3%最佳。

2.2.4 发酵时间对发酵后蛋白质和多糖含量的影响

菌种的发酵时间对复合中药渣发酵生产功能性饲料具有重要的参考价值。发酵时间过长，会导致在有限的空间范围内，微生物之间的竞争加剧，导致细菌的自溶，菌体数目下降，蛋白质和多糖的含量降低；发酵时间太短，则发酵后产量过低。发酵时间对混合菌种发酵后蛋白质和多糖含量的影响如图5所示。

由图5 可知，在前4 d，蛋白质与多糖的含量均有下降，是因为在前期微生物生长的过程中，不断地消耗培养基中的营养物质以供自己所需。在第5 d 时，蛋白质含量有所提升；第6 d 时，蛋白质与多糖含量达到最高，蛋白质含量为9.96%，多糖含量为8.95%；第7 d 时，蛋白质与多糖含量再次开始下跌。因此最佳发酵时间为6 d。

图5 接种时间对发酵后蛋白质和多糖含量的影响

3 结论

本试验选取枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、黑曲霉作为发酵菌种，对中药渣（包括甘草、茯苓、蒲公英等常见中药种类）进行发酵，以蛋白质含量和多糖含量作为主要评价指标，确定了最佳工艺条件：接种比例枯草芽孢杆菌∶产朊假丝酵母∶黑曲霉2∶1∶2，接种量3%，添加30 mg/mL 玉米粉作为氮源，初始pH 7.5，发酵6 d 后，发酵底物中蛋白质含量为9.96%，多糖含量为8.95%，蛋白质含量比未发酵药渣提高了47.3%，多糖含量提高了1.4%。

目前，全国产生的药渣残留物质量很大，诸如各大药厂制药后所剩药渣，煎制中药后所剩残留物等。已有研究表明，在饲料中添加中药渣可以促进畜禽的生长发育[8-9]。如果可以将这种方法广泛应用，选用适合的混合菌种进行中药渣的发酵，促使药渣中的蛋白质、多糖含量增加，将其发酵产物作为功能性饲料资源或农业化肥使用，减少了环境污染，避免了资源浪费。