甲基红褪色光度法测定司帕沙星含量的研究

李新华，袁 泉，岳志劲，刘永文

（山西大同大学化学与化工学院，山西大同 037009）

司帕沙星是第三代喹诺酮类抗菌药，其药理作用是通过阻碍细菌的DNA合成而产生杀菌作用，对多种细菌有强大抗菌作用，因此对微生物感染的相关疾病都有良好的治疗作用，主要用于呼吸、泌尿、肠道、胆道、皮肤软组织等感染。目前，测定司帕沙星含量的方法主要有毛细管电泳高频电导法[1]、流动注射化学发光法[2]、高效液相色谱法[3]、荧光猝灭法[4]、紫外分光光度法[5]等，但未见司帕沙星与甲基红反应形成荷移络合物的褪色光度法测定司帕沙星含量的报道。

以甲基红为显色剂，通过其与司帕沙星作用，使甲基红发生明显的褪色反应[6-11]，根据吸光度值的降低来测定司帕沙星药片中的司帕沙星含量。该法简单、快速、灵敏，无需昂贵的仪器及试剂，与文献比较结果满意。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

FA2204 电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)；722E 分光光度计、PHS-3C 型精密酸度计（上海大普仪器有限公司）；HH-2 恒温数显水浴锅（国华电器有限公司）。

1.00× 10-3mol/L 司帕沙星储备液：取0.039 2 g司帕沙星对照品（含量99.8%，中国药品生物制品鉴定所），用无水乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶，并用黑色塑料膜包裹，避光保存，用时用无水乙醇稀释至所需浓度。

1.00× 10-3mol/L 甲基红溶液：取0.026 9 g 甲基红，用无水乙醇溶解，定容至100 mL，用时用无水乙醇稀释至所需浓度。

醋酸-醋酸钠缓冲溶液：取5.90 mL 冰醋酸稀释至500 mL，配成0.2 mol/L 的醋酸溶液；取13.808 g 醋酸钠，稀释至500 mL，配成0.2 mol/L 的醋酸钠。以不同比例配成不同pH值的缓冲溶液。

其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

司帕沙星片（大同五洲通制药有限责任公司）为市售品，批号20190401，规格0.1 g×6片。

1.2 实验方法

在10 mL 的容量瓶中加入4.00 mL 的1.00×10-4mol/L甲基红溶液和1.00 mL pH=3.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，再加入一定量的司帕沙星储备液，加水定容，摇匀。静置10 min，用1 mL 的比色皿测定吸光值（λ=553 nm），计算ΔA=A0-A。其中A0为空白试剂的吸光度值，A为含有司帕沙星的试剂的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱与机理讨论

用SP-722E 型分光光度计，分别对甲基红-司帕沙星溶液（以空白试剂为参比）和甲基红溶液、司帕沙星溶液、甲基红-司帕沙星溶液（以水为参比），在320～700 nm 波长范围内进行测定，得到吸收光谱曲线（图1）。由图1 可知，当以水为参比时甲基红在530 nm 处有最大吸收峰（曲线a）；而司帕沙星相对水而言溶液几乎没有吸收（曲线c）；向甲基红溶液中加入司帕沙星溶液之后，吸光值降低，波峰蓝移至510 nm处，在350～500 nm 之间较不加入司帕沙星溶液的吸光值高，在500～630 nm 之间的吸光值较不加入司帕沙星溶液的吸光值低（曲线b）；以试剂空白为参比时，加入司帕沙星的甲基红溶液在553 nm 处形成波谷（曲线d）。以上事实表明，甲基红与司帕沙星在波长500～630 nm之间发生了褪色反应。

图1 司帕沙星-甲基红体系的吸收光谱

司帕沙星对甲基红褪色反应的机制可能是由于司帕沙星的分子结构中-F 富电子，可作为给电子体；甲基红中苯环的羧基及邻位的氮氮双键的相互作用，使两个苯环电子云密度降低，苯环缺电子，可作为受电子体。因此，在pH=3.5 的条件下，甲基红中缺电子的苯环与司帕沙星中富电子的-F 通过电荷荷移形成1∶1 的络合物[11]（配位比的测定用等摩尔系列法）。反应机理见图2。

图2 反应机理

2.2 实验条件的选择

以试剂空白为参比，553 nm 为测定波长，以4.00×10-6mol/L 的司帕沙星标准溶液为实验条件进行优化。

2.2.1 甲基红浓度和用量的影响

选取10 个10 mL 的容量瓶，分为A、B 2 组，其中A 组作为空白对照。在A、B 组中分别加入1.00×10-4mol/L 甲基红溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，再依次加入1.00 mL 的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH=3.5)，然后在B 组溶液中加入4.00×10-6mol/L 的司帕沙星标准溶液2.00 mL。按照2.2 节的实验方法测定ΔA，结果见图3。由图可知，当甲基红的用量在1.00～4.00 mL(即甲基红的浓度为1.00×10-5～4.00×10-5mol/L)时，溶液的吸光度降低值ΔA随甲基红的用量增加而增大；当甲基红的用量为在4.00～5.00 mL(即甲基红的浓度为4.00×10-5～5.00×10-5mol/L)时，溶液的吸光度降低值ΔA随甲基红的用量增加而降低。这可能是因为甲基红与司帕沙星缔合后，过量的甲基红溶液使缔合物的吸光值受到影响。因此，本实验选择甲基红的用量为4.00 mL，即甲基红溶液的浓度为4.00×10-5mol/L。

图3 甲基红浓度的影响

2.2.2 缓冲溶液和pH的探讨

实验比较了醋酸-醋酸钠、Britton-Robinson（BR）、KH2PO4-NaHPO4（PB）、盐酸-醋酸钠、六次甲基四胺和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液作为实验的反应介质，对甲基红与司帕沙星荷移络合物反应的影响情况。结果表明，PB 缓冲体系有浑浊出现，透光度不好；在六次甲基四胺缓冲溶液中无明显褪色现象；柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液褪色现象不明显，ΔA较小；BR、盐酸-醋酸钠、醋酸-醋酸钠缓冲溶液中褪色现象最为明显，且三者吸光度下降值ΔA的差值很小。

环境的酸碱性对司帕沙星与甲基红荷移络合物解离影响较大，进而影响到二者的缔合。因此，本实验首先考虑缓冲体系的pH值对褪色现象的影响。在酸性碱性中性的缓冲体系下分别做定性实验，可知在酸性缓冲体系下甲基红与司帕沙星有褪色现象，因此，选定酸性缓冲体系进行实验。

选用20个10 mL的容量瓶分为2组，一组作为空白试剂，在20 个10 mL 的容量瓶中，依次加入1.00×10-4mol/L 甲基红溶液4.00 mL、pH 在1.0～5.5 的醋酸－醋酸钠缓冲溶液1.00 mL，然后在另一组溶液加入4.00×10-6mol/L的司帕沙星标准溶液2.00 mL，2组溶液均用蒸馏水定容至10 mL。按照2.2 节实验方法测定ΔA，结果见图4。结果表明，当醋酸－醋酸钠缓冲溶液的pH=3.5 时，ΔA值最大，褪色现象最明显。同时本实验还考察了缓冲液用量对荷移反应的影响情况。结果表明，当移取量为1.00 mL时，褪色现象最明显，ΔA值最大。因此，本实验中缓冲溶液的最佳条件为移取1.00 mL pH=3.5的醋酸－醋酸钠缓冲溶液。

图4 pH的影响

2.2.3 表面活性剂的影响

试验了阴离子型和阳离子型表面活性剂及非离子表面活性剂对甲基红－司帕沙星荷移反应的影响情况。结果表明，十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基三甲基铵和曲拉通X－100 对测定结果的影响较小，因此，实验中不加入任何类型的表面活性剂。

2.2.4 温度和时间的影响

（1）时间对褪色作用的影响

室温下，在不同的反应时间10、20、30、40、50 min里，分别对吸光度降低值ΔA进行测定，结果显示，对应的ΔA为0.386、0.386、0.394、0.397、0.397。由此可见，司帕沙星与甲基红荷移反应10 min 时ΔA为0.386，此后随着时间的延长ΔA增加不是太大，因此，实验选择10 min作为反应时间。

（2）温度对褪色作用的影响

在15、25、35、45、55、65 ℃分别对吸光度降低值ΔA进行测定，结果显示，ΔA值分别为0.380、0.380、0.360、0.342、0.330、0.314。可见，当温度为15～25 ℃之间时，吸光度降低值ΔA几乎不变化；当温度在25～65 ℃之间时，ΔA随温度的升高逐渐降低。因此，实验选择在室温下进行。

2.2.5 加样顺序对实验结果的影响

甲基红和醋酸－醋酸钠缓冲溶液加样顺序对测定结果的影响。试验结果表明，先加甲基红溶液然后与醋酸－醋酸钠缓冲溶液混合后再加入司帕沙星溶液作为加样顺序效果最佳。

3 干扰试验

在所选择的实验条件下，用4.00×10-6mol/L 的司帕沙星标准溶液进行干扰实验，考察了常见药物添加剂及常见离子（分子）对该测定方法的影响情况。结果表明，当向4.00×10-6mol/L 的司帕沙星标准溶液中分别加入淀粉、葡萄糖、赋形剂滑石粉、蛋白质、硬脂酸镁、糊精、组氨酸、色氨酸和乳糖及一些常见金属离子（Na+、K+、NH4+、Al3+、Ca2+、NO3-、Cl-、Cu2+、Fe3+、Pb2+）实验表明，一定量的常见金属离子、无机酸根离子、糖类、蛋白质、氨基酸对司帕沙星测定的结果影响较小，相对误差均小于5%。所以，本法具有较高的选择性，可用于实际样品的测定。

4 标准曲线的绘制

分别取1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00、2.20、2.40、2.60、2.80、3.00 mL 1.00×10-5mol/L 司帕沙星乙醇溶液加入10 mL容量瓶中，按照上述的实验方法对其进行测定，绘制出标准工作曲线见图5。

图5 司帕沙星标准工作曲线

ΔA与司帕沙星的浓度在1.00×10-6～3.00×10-6mol/L 范围内呈线性，线性方程为ΔA=0.14936c+0.09909，r2=0.997。计算出表观摩尔吸光系数为K=2.10×105L/（mol•cm）。再做20次空白实验，对其进行连续测定，求出标准偏差δ=1.00×10-3，按检出限的计算公式CLOD=3×δ/K，求得检出限D=6.00×10-7mol/L。

5 实际样品的测定

5.1 司帕沙星试样的制备

称取0.239 4 g 司帕沙星片剂，研磨均匀，用乙醇溶解，抽滤，洗涤，除去不溶物，定容于250 mL容量瓶中，摇匀，备用。再取1 mL稀释到100 mL容量瓶中。

5.2 试样的测定

取2.00 mL 的试样溶液于10 mL 容量瓶中，用上述1.2 节的实验方法进行测定，对照工作曲线求得2.00 mL 中司帕沙星的含量，然后加入一定量的司帕沙星标准溶液，进行回收率测定，结果见表1。

表1 药物制剂中司帕沙星含量的测定及回收率

6 结论

试验了司帕沙星与甲基红在酸性条件下形成荷移络合物，在波长553 nm条件下，发生褪色反应的各种适宜条件。结果表明，在pH=3.5的醋酸－醋酸钠缓冲溶液中，当依次加入4.00 mL浓度为1.00×10-4mol/L的甲基红溶液、1.00 mL的醋酸－醋酸钠缓冲溶液和一定量的司帕沙星溶液，常温下放置10 min 左右，此时甲基红与司帕沙星已完全荷移，使甲基红溶液发生明显的褪色现象，体系非常稳定，且在10 h 内稳定。司帕沙星与甲基红溶液反应形成配位比1∶1的荷移络合物，本实验测定了药物制剂中司帕沙星的含量，其相对标准偏差RSD=1.52%，回收率为101.5%。该方法操作简单、可靠性强、具有较高的精密度和准确度，可用于准确测定药剂中司帕沙星的含量。