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青海省不同地区羌活挥发性成分AOE含量的测定

2021-04-06李容榕盛观星林小艳

关键词:超临界水蒸气挥发性

李容榕,盛观星,林小艳

(1.青海民族大学药学院,青海西宁 810007;2.青海省青藏高原植物化学重点实验室,青海西宁 810007)

羌活,又称“护羌使者”,为伞形科羌活属植物羌活Notopterygium incisum Ting exH.T.Chang或宽叶羌活Notopterygium foriesii Boiss的干燥根茎[1]。羌活为常用中、藏药材,许多中、藏医典籍均有记载,其味辛、苦,性温,具有解表散寒、祛风除湿、止痛活血等功效。临床用于改善胃肠消化吸收功能、治疗妇科疾病、风寒感冒、头痛项强、风湿痹痛等病证[2]。现代药理学研究,羌活具解热、镇痛、抗炎、抗过敏、抗病毒、增加脑血流量、抗血小板凝集、抗心肌缺血、抗心律失常、抗哮喘、抗海洋污损活性等作用[3-9]。羌活化学成分种类繁多、成分复杂,主要含有挥发油和香豆素类化合物,此外还有氨基酸、有机酸、多糖、微量元素等[10-12]。

AOE 即植物抗氧化酶,包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等,是普遍存在于植物各种组织中的复合酶系。与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系,经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。

1 材料、试剂及仪器

1.1 材料与试剂

实验所用药材,经青海民族大学药学院林鹏程教授鉴定,为伞形科羌活属植物羌活及宽叶羌活。2018 年6-8 月分别采自青海省互助北山林场(2 种)、大通县、祁连县3个地区,4种。弃去植株根部以上部位,用纯水冲洗根部、阴干,粉碎,过40目筛,备用。

甲醇(分析纯,天津富宇精细化工有限公司);RO纯水(自制)。96T 植物抗氧化酶(AOE)活性酶联免疫分析试剂盒(江苏麦莎实业有限公司,LOT NO:18112808H)。

1.2 仪器

FLUOstar Omega 全自动多功能酶标仪(德国BMG LABTECH 公司);GZX-9076MBE 型数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);UPHIV-10T 型优普系列超纯水机(成都超纯科技有限公司);AL204 型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);KDM 型调温电热套(西安森海石油设备有限公司);Spe-ed SFE-4 超临界流体萃取装置(美国ASI应用分离公司);FW177型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);SDC-6 型低温恒温槽(南京新辰生物科技有限公司);挥发油提取器(上海申玻仪器公司);40 目标准筛(绍兴市上虞新达净化仪器厂)。

2 方法

2.1 羌活挥发性成分提取

超临界CO2萃取法:取备用样品20 g 置于超临界CO2萃取釜中,压力360 MPa、温度50 ℃条件下,静态萃取15 min,动态萃取45 min,得不同地区羌活萃取物。

水蒸气蒸馏法:取备用样品20 g 置于圆底烧瓶中,按照《中国药典(2015 版)》挥发性成分提取项下仪器组装,进行提取。

提取得率、颜色等状态详见表1。

表1 不同地区羌活挥发性成分颜色及提取率

2.2 样品处理

取上述提取所得挥发性成分(编号QH1-QH8)适量于70%甲醇中,配制为5.0 mg/mL溶液,备用。

2.3 标准曲线绘制

取所购买植物抗氧化酶(AOE)试剂盒中原倍标准品,按照表2进行稀释。

分别设空白孔与标准孔。在酶标包被板上,标准孔内分别准确加入1号至5号标准品50 μL于酶标板孔底部,轻轻晃动混匀。

封板膜封板后置于37 ℃环境中温育30 min。揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30 s后弃去,如此重复5次,拍干。

洗涤结束后,空白孔除外,每孔加入酶标试剂50 μL。用封板膜封板置37 ℃环境中温育30 min。取出,揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30 s后弃去,如此重复5次,拍干。

洗涤结束后,每孔中先加入显色剂A 50 μL,再加入显色剂B 50 μL,震荡混匀,37 ℃避光环境中温育、显色15 min 后,每孔中加入终止液50 μL,终止显色反应,此时蓝色立即转为黄色。

孔板置于酶标仪,调零,反应终止15 min 内,450 nm 波长下依序测量各孔的吸光度(OD值)。

标准品浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘制标准曲线得出线性回归方程式。

2.4 样品测定

待测样品孔中加入样品稀释液40 μL,再加待测样品10 μL。后续步骤同标准曲线的绘制的方法。

3 结果

3.1 标准曲线及回归方程

植物抗氧化酶(AOE)含量测定标准曲线线性回归方程为:y=0.0813x+0.0245,r2=0.9997。曲线见图1。

图1 植物抗氧化酶(AOE)含量标准曲线

3.2 精密度实验

按照上述操作步骤,重复测定5 次,结果显示待测样品的植物抗氧化酶(AOE)含量的RSD为0.7%~1.6%,表明该方法精密度良好。

3.3 重复性实验

按照上述操作步骤,称取同一待测样品5份进行测定,结果显示待测样品植物抗氧化酶(AOE)含量的RSD为0.8%~1.7%,表明该方法重复性良好。

3.4 样品测定结果

水蒸气蒸馏法得挥发性成分中植物抗氧化酶(AOE)含量较高,超临界CO2萃取法的挥发性成分中植物抗氧化酶(AOE)含量较低。各样品中植物抗氧化酶(AOE)含量见表3。

表3 不同地区羌活挥发性成分植物抗氧化酶(AOE)含量表

4 结论

实验结果表明:水蒸气蒸馏得羌活挥发性成分中植物抗氧化酶含量明显高于超临界CO2萃取法所得羌活挥发性成分。水蒸气蒸馏羌活挥发性成分中,不同地区之间的植物抗氧化酶含量有较大差异,采自青海省互助北山林场的羌活AOE 含量最高,达9.99 U/g,其次是祁连县宽叶羌活、互助北山林场宽叶羌活,采自青海省大通县的羌活植物抗氧化酶(AOE)含量最低,为5.09 U/g。超临界CO2萃取得青海省不同地区羌活挥发性成分的AOE 含量无明显差异,均低于4.00 U/g。

水蒸气蒸馏法提取得到的羌活挥发性成分中AOE含量高,超临界CO2萃取法提取的羌活挥发性成分AOE 含量较低,且无明显地区差异性。采用不同提取方法、不同提取溶剂选择,对提取物成分、含量、状态均有明显影响,尤其对羌活挥发性成分AOE 提取率有显著影响。与超临界CO2萃取法相比,水蒸气蒸馏法传统、经典,且提取溶剂是水蒸气,得到的挥发性成分中除挥发油外脂溶性成分含量极低,AOE含量较高。

AOE 含量可以较好地反映出不同地区羌活抗氧化活性的强弱,同时反映出不同提取方法对植物抗氧化酶提取的影响。

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