漆酶催化碘化竹材的防腐性能*

饶 瑾 王 慧 Nayebare Kakwara Prosper 王 婕 姜 俊 杨秀树 刘庭菘 孙芳利

(1.浙江农林大学工程学院 杭州 311300； 2.杭州市化工研究院有限公司 杭州 310014)

竹子曾被誉为“穷人的材料”，但由于其环保、高效又优雅，一跃成为当之无愧的新时代生态材料； 尤其在木材资源短缺的当下，可持续、绿色环保的竹材是替代木材的一个很好选择(李延军等，2016)，可广泛应用于室内外家具、地板和装饰等领域。与木材相同，竹材主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，容易遭受腐朽菌降解，且竹材中丰富的糖类、淀粉和蛋白质等也能为霉菌和腐朽菌所利用，在使用过程中容易发生腐朽和霉变(孙芳利等，2006)。腐朽会造成竹材力学强度下降，严重时甚至完全失去使用价值(王文久等，2000)，因此，防腐处理对于竹材高效和可持续利用具有重要意义。

目前，竹材防腐大多借鉴木材防腐处理方法，常用的防腐剂有五氯酚钠、铜铬砷化合物(chromated copper arsenate，CCA)、铜季胺盐(ammoniacal copper quaternary，ACQ)和铜唑(copper azole，CA)等，其中五氯酚钠和CCA因对环境和人畜毒性较大而被禁止或限用(孙芳利等，2017)。相比之下，ACQ和CA可有效抑制真菌侵入，毒性相对较小，但其最大的缺点是铜流失，长期使用该类防腐剂不仅会对水体和土壤造成一定危害(Schultzetal.，2002)，而且处理材易霉变也使该类防腐剂难以直接用于木竹材保护，因此非金属或有机杀菌剂，如硼化合物、三唑类和天然提取物等，成为木竹材保护领域研究和应用的新方向(Obandaetal.，2008； 周月英等，2013； 沈哲红等，2009)； 但是这些杀菌剂也存在抗流失性差和长效性短问题。长期以来，人们利用铬的络合作用提高铜、锌和砷在木材中的固着性，如CCA、铜铬硼(CCB)和铜铬锌(CZC)等，而在ACQ和CA中，铜离子则通过与木质素络合而固着，前者采用重金属铬，对环境污染较大，后者对铜离子的固着性较弱，仍有铜离子流失，也会造成环境污染。可见，探索新的、更为天然环保的途径固着具备抑菌和抗菌功能的化合物或基团具有重要的科学价值和应用前景。漆酶是一种从植物和真菌中提取出来的环保型生物催化剂(Sharmaetal.，2007； Widstenetal.，2009)，能够催化氧化碘化物产生碘自由基，还能氧化多种芳香族和非芳香族化合物，在高分子化合物木质素的降解和交联中起着重要作用(曹明乐等，2012； Witayakranetal.，2010； Yoshikawaetal.，2012； Prosperetal.，2018)。碘及其衍生物具有较好的杀菌性，且毒性低，但应用到木竹材中同样存在抗流失性差的问题(肖忠平等，2010)。 如果能够通过漆酶的催化氧化作用将碘固着于竹材上，则可提高竹材的抗菌性能，同时抗流失性差的问题也会得到一定程度解决。鉴于此，本研究利用漆酶催化氧化碘化物产生碘自由基的特性，探索将具有杀菌或抑菌作用的活性成分固着于竹材上，提高竹材的防腐性能和抑菌成分的固着性，以期为木竹材保护和改性提供一种环保、高效的新方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材 3～4年生新鲜毛竹(Phyllostachysedulis)采自浙江省杭州市临安区三口镇，去除竹青和竹黄后制成精刨竹条，规格为20 mm(L)× 20 mm(T)× 5 mm(R)，流失和未流失组中每种处理各设6个重复试样； 饲木为马尾松(Pinusmassoniana)和青杨(Populuscathayana)边材，规格为20 mm(R)× 20 mm(T)× 5 mm(L)。

1.1.2 菌种 白腐菌选用彩绒革盖菌(Trametesversicolor)，褐腐菌选用密黏褶菌(Gloeophyllumtrabeum)，购自广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.3 药剂 磷酸二氢钾(KH2PO4，AR，杭州华东医药集团有限公司)； 碘化钾(KI，AR，杭州华东医药集团有限公司)； 2，2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS，上海阿拉丁试剂有限公司)； 活性为0.50 U·mL-1的漆酶(Laccase，Sigma-Aldrich公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 试样漆酶碘化钾处理 采用加压浸渍法将漆酶、碘化钾和ABTS等药剂浸渍到竹材内进行原位反应，探究不同酶活的漆酶催化碘化竹材的防腐性能。具体方法如下：首先配制pH=5.0的磷酸盐缓冲液(PBS)作为各处理液的溶剂，然后配制不同酶活的漆酶碘化钾混合溶液，具体配方和编号按表1进行，未经任何处理的试样作为对照样。将干燥后的待处理试样放入500 mL烧杯中，上压带孔的玻璃压片以防试样浮出，置于真空处理罐中，抽真空至 0.1 MPa，保持30 min后恢复常压，吸入配制好的混合溶液，静置2 h后取出烧杯置于水浴锅中，40 ℃恒温处理20 h使其充分反应，反应结束后取出试样。

表1 试样处理配方Tab.1 Sample treatment description

1.2.2 流失试验 为探索流失前后竹材的防腐性能变化，按照AWPA E11—2007《Standard Method of Determining the Leachability of Wood Preservatives》进行流失试验。具体步骤如下：取处理好的编号为Control、KI、0.05LAK、0.18LAK和0.60LAK的试样分别放入500 mL烧杯中进行浸渍，将烧杯置于真空装置中，抽真空至 0.1 MPa，保持30 min，恢复常压后取出放在恒温震荡器上进行流失试验，每种处理设6个重复试样，按照每个试样50 mL加入蒸馏水浸没试样，先每隔6、24和48 h更换1次蒸馏水，后每隔48 h更换1次蒸馏水，共计14天。收集所有流失液待测，流失试验后的试样分别标记为L-Control、L-KI、L-0.05LAK、L-0.18LAK和 L-0.60LAK。

1.2.3 防腐性能试验 参考ASTM D1413—99《Standard Test Method for Wood Preservatives by Laboratory Soil-Block Cultures》，无菌条件下将待测腐朽菌分别接入培养皿，在温度(25±2)℃、相对湿度75%±5%的环境中培养2～3周，待菌丝布满整个培养皿后，用打孔器从菌丝边缘取直径为4.5 mm的菌饼，待用。向培养瓶中加入保水率32.1%、pH6.3的土壤培养基，添加量为115 g·120 cm-3。先将饲木按照每瓶2块放入，121 ℃蒸汽灭菌锅中灭菌30 min，然后在无菌环境下将上述菌饼放入培养瓶中心，接好后置于温度(25±2)℃、相对湿度75%±5%的培养箱中培养2～3周，使菌丝长满饲木。

将流失试样和未流失试样置于(103±2)℃烘箱中烘至绝干后称重(精确到0.001 g)，记为m1。待培养瓶中菌丝长满饲木时，在无菌条件下将绝干后的试样接到饲木上，置于温度(25±2)℃、相对湿度75%±5%的恒温恒湿箱中进行防腐性能试验。3个月后取出，轻轻擦拭掉试样表面的菌丝，气干3天后置于(103±2)℃烘箱中烘至绝干后称重，记为m2。以腐朽前后试样的质量损失率(mass loss,ML)作为评价标准，最终数据取平均值±标准偏差，具体公式如下：

ML=(m1-m2)/m1×100%。

1.2.4 SEM和XPS分析 为进一步研究漆酶催化碘化竹材的防腐性能，选取L-Control和L-0.60LAK经白腐菌和褐腐菌侵染后的试样进行SEM和XPS分析。制备横切面和径切面样品，绝干后置于载物台上进行喷金处理，采用扫描式电子显微镜(TM 3030，日本日立)观察样品微观结构，使用X射线光电子能谱仪(Thermo Fisher Scientific，USA)对试样进行XPS分析，以单色化A1 Kα射线(1 486.6 eV)为靶材，在真空度小于5×10-7Pa的分析室中扫描试样，扫描步长0.1 eV，扫描范围0～1 100 eV。

2 结果与分析

2.1 流失前后竹材防白腐菌效果

图1为试样流失前后对白腐菌的耐腐性能结果。未处理竹材质量损失率为18.75%±1.01%；经3个月腐朽后，单独碘化钾处理竹材质量损失率为11.75%±0.82%；漆酶催化碘化竹材的质量损失率明显降低，酶活为0.05、0.18和0.60 U·mL-1的漆酶催化碘化竹材质量损失率分别为8.74%±0.78%、8.43%±0.80%和7.92%±0.51%，均低于10%，属于强耐腐等级，说明漆酶催化碘化竹材可提高竹材的防白腐性能。分析其原因，可能是漆酶作用于竹材中的木质素，使其产生自由基，同时漆酶能够氧化碘化钾产生碘自由基，二者反应后使碘结合到木质素上，形成具有抗菌作用的复合物。由于抗菌成分碘与竹材发生反应，提高了碘在竹材中的固着性，这一点在Prosper 等(2018)中已得到证明，漆酶催化碘化竹材后，碘的固着性从3.7%提高至50.1%。若防腐剂能够通过化学结合固着于竹材中，则能够抵抗流失，保持稳定的防腐性能(王雅梅等，2008)。对流失后的处理竹材进行防腐试验，单独碘化钾处理竹材质量损失率升至12.9%±1.22%，漆酶催化碘化竹材质量损失率均低于10.5%±1.34%，其中酶活0.60 U·mL-1的漆酶催化碘化竹材防白腐菌效果最佳，质量损失率只有9.85%±0.64%(图1b)。由此得出，漆酶催化氧化碘化钾处理后竹材具有较好的防腐性能和抗流失性，这一性能将拓宽该防腐技术的应用领域，为高效、环保和抗流失的竹材防腐处理提供新思路。

图1 未流失试样(a)和流失试样(b)经白腐菌腐朽后的平均质量损失Fig. 1 The average mass losses for unleached (a) and leached (b) samples exposed to T. versicolor

2.2 流失前后竹材防褐腐菌效果

白腐菌主要降解木质素，褐腐菌主要降解纤维素和半纤维素，因此褐腐菌比白腐菌对竹材的降解更严重(金重为等，1989； 马星霞等，2012)。由图2可知，防腐试验结束后未处理竹材质量损失率为24.95%±0.80%，远高于褐腐菌腐朽后的质量损失率。单独碘化钾处理能提高竹材的耐褐腐性，质量损失率降至14.3%±0.53%。通过漆酶催化碘化竹材可进一步提高竹材的防腐性能，酶活0.05、0.18和0.60 U·mL-1的处理竹材接种褐腐菌后质量损失率分别为12.94%±0.81%、9.51%±0.91%和9.44%±0.74%，均低于未处理竹材和单独碘化钾处理竹材，且漆酶酶活越高，防腐性能越好。试样经14天流失试验后，单独碘化钾处理竹材质量损失率从14.3%±0.53%提高至15.34%±0.88%，0.60 U·mL-1漆酶催化碘化竹材质量损失率从9.44%±0.74%提高至10.35%±0.78%，可见，即使经过流失处理，漆酶催化碘化竹材仍能保持较高的防腐性能。结合2.1可知，漆酶催化碘化竹材后质量损失率均有所下降，3种不同酶活漆酶的防腐效果差距不是特别明显，但能看出酶活0.60 U·mL-1的漆酶催化碘化竹材不管是否经过流失试验，其质量损失率均是最低的，由此说明酶活0.60 U·mL-1的漆酶催化碘化竹材防腐效果较佳。

2.3 防腐试验后试样的形貌变化

采用扫描电镜观察流失试验后未处理材和0.60 U·mL-1漆酶催化碘化竹材受腐朽菌腐朽后的微观结构差异，结果如图3、4所示。未处理竹材经白腐菌侵染3个月后菌丝深入细胞腔，细胞壁也出现分层松散情况。从纵切面(图3c)来看，导管周围有明显穿孔现象，且随着腐朽加深，穿孔开始连成一片。一般来说，腐朽菌侵害竹材均是从导管处侵入，在其中大量繁殖后才向周边扩散(陈敏忠等，1995)。从图3b和图3d可看出，处理竹材细胞腔中未见菌丝，各组织结构较完整，未被破坏，这说明0.60 U·mL-1漆酶催化碘化竹材具有较好的耐白腐性。

图2 未流失试样(a)和流失试样(b)经褐腐菌腐朽后的平均质量损失Fig. 2 The average mass losses for unleached (a) and leached (b) samples exposed to G. trabeum

图3 流失试样经白腐菌腐朽后的SEMFig. 3 SEM of samples after leaching exposed to T. versicolor a和c为未处理材横切面和径切面； b和d为处理材横切面和径切面。下同。a and c are the transverse section and the radial section of untreated bamboo; b and d are the transverse section and the radial section of treated bamboo.The same below.

未处理竹材经褐腐菌腐朽后的质量损失率高于白腐菌，这是因为白腐菌分解木质素能力较强，褐腐菌则破坏纤维素和半纤维素，竹材中纤维素和半纤维素占比大，故质量损失率较高。从图4a可看出，未处理竹材质地脆弱，细胞完整性已遭到严重破坏，不仅细胞壁变薄、胞间层降解，而且细胞壁上存在非常明显的穿孔现象。处理竹材虽然细胞腔中出现零星菌丝，但是穿孔并不明显，细胞壁也未收缩和变形。从纵切面(图4c)来看，菌丝深入细胞腔，从一个细胞钻到另一个细胞，常常直接钻过纹孔，由此导致菌不断向邻近细胞蔓延，细胞壁变薄且纹孔破坏，最终使未处理竹材的结构严重降解。处理竹材虽有少量菌丝附着，但细胞结构较完整，由腐朽菌造成的穿孔较少。从以上分析可证实褐腐菌侵染竹材造成的降解破坏比白腐菌严重。

2.4 腐朽前后的XPS分析

为进一步探索漆酶催化碘化竹材的防腐机制，对腐朽前后的0.60LAK处理竹材进行XPS分析(表2)。图5为腐朽前后竹材表面的C1s XPS谱图，结合表2可看出，代表木质素含量的C1峰经白腐菌侵染后下降较多，这是因为白腐菌主要降解木质素，导致木质素含量相对降低，而对纤维素和半纤维素影响不大。褐腐菌侵染后处理竹材C1和C2峰均下降，是因为褐腐菌主要降解纤维素和半纤维素，对木质素也有一定改变和降解作用。以上结果说明，白腐菌造成的9.85%质量损失率主要源于木质素降解，而褐腐菌造成的10.35%质量损失率主要源于纤维素和半纤维素降解。腐朽前后O/C变化不明显，进一步说明2种菌对0.60LAK处理竹材氧化程度较低，没有造成太大破坏。相关文献表明，漆酶可催化氧化竹材木质素中的酚羟基形成苯自由基或苯氧自由基，同时也可催化碘离子形成碘自由基，经自由基反应后形成C—I共价键(Prosperetal.，2018)。经过14天流失试验，绝大部分可溶的KI或I2都会从竹材中流失，I/C可用于评估竹材中C—I键的组成情况，0.60LAK处理竹材经14天去离子水处理后I/C为0.002 7，这说明KI通过漆酶介体系统与竹材发生反应，从而形成稳定的C—I键，也正是由于这部分C—I键的存在，才使0.60LAK处理材产生一定的防腐性能。

图4 流失试样经褐腐菌腐朽后的SEMFig. 4 SEM of samples after leaching exposed to G. trabeum

表2 处理材腐朽前后的O/C、I/C以及不同化学态C的百分比①Tab.2 O/C ratio, I/C ratio and Carbon states of treated bamboo before and after decaying

图5 处理竹材腐朽前后表面的C1s XPS谱Fig. 5 C1s XPS spectra of treated bamboo before and after decaying

3 讨论

白腐菌和褐腐菌是2种造成竹材腐朽的常见真菌，对竹材破坏较为严重。腐朽后竹材结构发生严重破坏，质地松软，结构不完整，几乎失去利用价值(任红玲等，2013； 金重为等，1989)。本研究利用漆酶催化碘化钾产生碘自由基的特性处理竹材，经过3个月防腐试验和14天流失试验，探索漆酶催化碘化竹材的耐腐性能和抗流失性，并采用扫描电镜和X射线光电子能谱分析腐朽后试样的形貌特征和碳氧组成。结果表明，单独碘化钾处理能在一定程度上提高竹材的防白腐性能。漆酶催化碘化竹材可进一步提高防白腐性能，其中酶活0.60 U·mL-1的漆酶防白腐菌效果最佳，质量损失率只有7.92%，经流失试验后，质量损失率略有增加，为9.85%，仍能达到强耐腐等级。

褐腐菌腐朽3个月后未处理竹材质量损失率高达24.95%，这是由于褐腐菌能迅速降解纤维素，从而导致木材组织破坏和强度损失(于文喜等，1994； Zabeletal.，1992)。0.60 U·mL-1漆酶催化碘化竹材质量损失率降至9.44%，属于强耐腐等级。经14天流失试验，0.60 U·mL-1漆酶催化碘化竹材质量损失率增加0.91%，说明漆酶催化碘化竹材经过流失试验对褐腐菌仍有较强的抵抗能力。

扫描电镜观察发现，未处理材经腐朽菌侵染后细胞壁松散，且有明显穿孔现象，导管上的纹孔破坏严重，特别是褐腐菌，这一点与马星霞等(2012)发现褐腐菌最先降解的部位是导管细胞壁的观点相同。而处理材菌丝少，结构较完整，破坏轻。腐朽后试样的XPS分析表明，0.60 U·mL-1漆酶催化碘化竹材对细胞壁物质的降解机制与文献报道一致(杜甫佑等，2005； 金重为等，1989)，白腐菌主要降解木质素，褐腐菌主要降解纤维素和半纤维素。

漆酶催化碘化竹材具有一定的防腐和抗流失性能，从长远来看，探索生物酶固着低毒或无毒杀菌剂以提高竹材的耐腐性具有重要意义。

4 结论

单独碘化钾处理竹材具有一定的防腐效果，但易流失。漆酶催化碘化竹材具有较好的防白腐和防褐腐性能，腐朽菌侵染3个月后质量损失率明显低于未处理竹材和单独碘化钾处理竹材。漆酶催化碘化竹材具有一定的抗流失性，流失试验后，漆酶催化碘化竹材质量损失率低于单独碘化钾处理竹材。利用生物酶催化氧化特性提高低毒或无毒抗菌剂的防腐性能和抗流失性能将为防腐处理向天然环保方向发展提供新的思路。