644例肺癌中HER-2 20外显子插入突变阳性率及临床病理分析

葛晓松，王晓莉，刘晓媛，刘 芬，高 翔，常树建

多项研究已经证实HER-2基因变异是肺癌的驱动基因之一，且部分靶向药物治疗有效[1-3]。其基因变异方式主要有两种：HER-2编码基因扩增或蛋白过表达、HER-2编码基因激活突变。其中，20外显子插入突变是肺癌中HER-2基因最常见的突变形式[4]。有文献回顾性分析了肺癌中HER-2 20外显子插入突变的阳性率及与临床病理特征的相关性[5-10]，而较少有文献报道肺癌中HER-2 20外显子插入与EGFR、ALK、MET、ROS1、BRAF、KRAS、NRAS、PIK3CA等9个驱动基因突变位点以及与PD-L1表达的相关性。本文采用荧光定量PCR法同时分析644例肺癌标本中9个驱动基因的突变情况，探寻HER-2 20外显子插入突变肺癌患者的临床特征，旨在为肺癌临床精准诊疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取2018年5月～2019年11月江南大学附属医院存档的手术切除、气管镜活检、胸水富集脱落细胞等标本合计644例。其中男性366例，女性278例，中位年龄65岁。病理类型：鳞状细胞癌60例，腺癌552例，无法区分鳞状细胞癌和腺癌1例，其他类型31例(包括腺鳞癌、小细胞癌、大细胞癌、肉瘤样癌、黏液表皮样癌、神经内分泌癌)。TNM分期：Ⅰ期267例，Ⅱ期42例，Ⅲ期88例，Ⅳ期248例，本实验经江南大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 肺癌标本中DNA及RNA的提取、纯化、保存及基因突变PCR检测提取方法严格按照试剂盒说明书操作，在确保无交叉污染的前提下，石蜡包埋组织连续4 μm厚切片10～20张，利用石蜡组织DNA/RNA共提取试剂盒(厦门艾德生物医药公司)提取基因组DNA及总RNA，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。所提取DNA于-20 ℃冰箱保存，总RNA于-70 ℃冰箱保存备用。人多基因突变检测试剂盒购于厦门艾德生物医药公司。PCR及RT-PCR操作严格按照试剂盒说明书进行，利用ABI7300型核酸扩增仪进行荧光定量PCR检测。

1.3 免疫组化PD-L1单克隆抗体E1L3N购于CST公司(USA)。免疫组化染色步骤：常规脱蜡水化；柠檬酸钠缓冲液中进行抗原热修复；3%双氧水室温孵育阻断内源性过氧化物酶的活性；滴加1 ∶400稀释的PD-L1单抗(E1L3N)，4 ℃过夜，PBS冲洗后滴加A液，室温孵育30 min，PBS冲洗；滴加新鲜配制的DAB工作液，室温孵育5～10 min；苏木精复染；无水乙醇脱水封片。以PBS液替代一抗或二抗作为阴性对照。染色后的切片，根据肿瘤细胞包膜染色阴性和阳性，计算肿瘤细胞PD-L1阳性比例分数(tumor proportion score, TPS)，计算公式为：切片中所有PD-L1阳性肿瘤细胞数量/切片中所有肿瘤细胞×100%。

1.4 统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计算中位年龄，分析HER-2 20外显子插入突变与患者年龄、性别、分期以及PD-L1表达的相关性，χ2检验分析差异是否有统计学意义，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌中驱动基因突变检测644例肺癌检测标本中，454例检测出驱动基因突变，突变阳性率为70.5%(454/644)，有469个突变位点(15例具有双突变)。驱动基因突变中发生率最高的是EGFR突变，总突变率为47.2%(304/644)，包括单外显子突变290例和双突变14例。ALK融合突变24例，RET 12例，ROS1 6例，KRAS 56例，NRAS 1例，MET 10例，PIK3CA 4例，BRAF 6例，HER-2 20插入突变32例(单外显子突变30例，合并RET突变1例，合并EGFR突变1例)，有190例患者未检测出上述任何突变形式，各种驱动基因突变数量及占总突变的比例见图1。

图1 肺癌标本中各驱动基因突变数量及占总突变比例分析：A.饼图分析；B.柱状图分析

2.2 肺癌中HER-2 20外显子插入突变的阳性率及临床病理特征的相关性肺癌中HER-2 20外显子插入突变阳性率为4.97%(32/644)，仅低于KRAS和EGFR的突变率。32例HER-2 20外显子插入突变阳性肺癌患者中，女性21例，男性11例(表1)。62.5%(20/32)为手术切除的小结节标本，其中高分化为17例，低分化2例，中分化1例，分化程度不详12例。其中1例女性(例8)合并有EGFR21外显子突变，1例男性(例32)合并有RET基因突变。

HER-2 20外显子插入突变阳性组均为腺癌，女性比男性多见(P=0.008)，患者年龄更轻(P=0.002)，中位年龄为45岁，而HER-2 20外显子插入突变阴性组中位年龄为65岁。同时HER-2 20外显子插入突变患者分化程度更高(P=0.002)，分期更早(P=0.005)。χ2分析结果表明，患者年龄、性别、分化程度及分期均与HER-2 20外显子插入突变相关，与肿瘤细胞PD-L1表达无相关性(表2)。

2.3 肺癌中HER-2与PD-L1阳性率的关系644例肺癌标本中，PD-L1蛋白表达检测了372例，总检测率为57.8%，阳性定义为TPS>1%。本组结果显示，PD-L1的总阳性率为50.3%(187/372)。其中HER-2 20外显子插入突变阳性患者共检测出18例PD-L1蛋白，检测率为56.3%(18/32)，阳性率为50%(9/18)。与HER-2 20外显子插入突变阴性患者PD-L1的阳性率(178/354，50.1%)相比，差异无显著性。

表1 32例HER-2 20外显子插入突变阳性肺癌患者临床资料

2.4 肺癌中HER-2 20外显子插入突变与HER-2过表达的关系HER-2免疫组化检测了176例，总检测率仅为27.3%。HER-2过表达免疫组化评分为3+。所有HER-2 20外显子插入突变阳性病例检测了8例HER-2的过表达情况，均未检测到HER-2 3+。本组结果显示：HER-2 20外显子插入突变与HER-2过表达之间无相关性。

3 讨论

本实验实现了HER-2 20外显子插入突变与其他8个驱动基因的同时检测。HER-2 20外显子插入突变阳性率为4.97%(32/644)，这与文献报道的阳性率相比略偏高[11-12]，原因可能是不同检测方法造成的，也有可能因为本组标本中腺癌比例高达85%，这与文献报道40%的比例存在一定的差异[13]，而HER-2 20外显子插入突变多发生于腺癌[5]。

表2 肺癌驱动基因突变与临床病理特征的相关性

本实验对另外8个驱动基因的突变阳性率也进行了分析，结果发现，这些驱动基因的阳性率与文献报道基本一致[14]，同时发现KRAS突变患者和HER-2 20外显子插入突变阳性患者的多个临床病理特征截然相反。表现为KRAS突变多发生于男性(P<0.001)，低分化(P=0.029)，且分期较晚(P<0.001)的患者。此外，实验亦发现2例HER-2 20外显子插入突变分别与EGFR21和RET存在双突变。有文献报道具有双驱动基因突变患者靶向治疗效果较差，预后欠佳。

肺癌中HER-2 20外显子插入突变的形式约30种，最常见的3个HER-2 20外显子插入突变片段分别为A775_G776ins(YVMA)、G776delinsVC(VC)和P780_Y781insGSP(GSP)，占所有HER-2 20外显子插入突变的94%[3]。本实验主要检测的也是该三种突变，但PCR法采用的是混合引物，无法进一步区分具体的突变形式，这也是目前绝大多数医院进行的驱动基因检测的缺点之一。有文献报道，HER-2 20外显子插入突变形式不同，对抗HER-2药物的反应差异较大[3]。因此，有必要进一步细分HER-2 20外显子插入突变的亚型，为更精准肺癌诊疗提供数据支持。

综上所述，利用荧光定量PCR法对肺癌标本中HER-2 20外显子插入突变进行检测，发现肺癌中HER-2 20外显子插入突变阳性率接近5%，因此该类型突变在肺癌中并非罕见，且均为腺癌，女性比男性更常见，同时HER-2 20外显子插入突变可与EGFR、RET等突变共存。本实验所得结果可能对未来临床指导肺癌精准靶向治疗有积极作用。