Akt2-Bad信号通路参与NSCLC凋亡*

蒋莉 何芳 刘丹 李为民 陈渤江

(1.川北医学院附属医院呼吸与危重症医学科，四川 南充 637000； 2.南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院，四川 南充 637000；3.川北医学院，四川 南充 637000；4.四川大学华西医院呼吸与危重症医学科，四川 成都 610041)

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt/mTOR信号通路是细胞内主要的信号通路之一，在细胞内基本功能中起着重要作用。 PI3K/Akt/mTOR通路调节细胞增殖、生长、细胞大小、代谢和运动。这一通路已被广泛研究，并被证实在人类肿瘤中普遍被激活。Bad 既是Bcl-2家族的一员，也是PI3K/Akt信号通路下游的调节因子。PI3K活化可激活PI3K依赖性的Akt，减少Bad与Bcl-XL和Bcl-2结合，阻止细胞色素C释放入胞浆，而抑制细胞凋亡[1-2]。EGFR/MEK/MAPK通路激活p90Rsk通过磷酸化Bad，调节细胞增殖、分化和凋亡[3-4]。除此之外，很多细胞因子都可通过使Bad失活而抗凋亡[5]。譬如：IL-3、PKA都可以通过细胞内信号转导通路使Bad失活，从而抑制Bad的促凋亡活性[6]。由此可见，Bad的调节是由多个蛋白之间相互作用而形成的复杂网络来实现的。

我们先前的研究发现，Bad过表达可抑制非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)的增殖，促进NSCLC尤其是肺腺癌细胞株H1299、SPC-A1、H292及大细胞肺癌H460的凋亡[7]。靶向沉默Akt2的表达也可以抑制NSCLC细胞增殖，促进其凋亡[8]。然而在NSCLC中，是否通过Akt2/Bad信号通路的形式来实现对肿瘤细胞凋亡的影响，目前尚不清楚。因此，我们构建了Bad过表达同时稳定干扰Akt2的NSCLC细胞株，通过检测体外细胞凋亡及凋亡信号通路下游蛋白，并选择肺腺癌细胞株H1299、SPC-A1构建移植瘤模型，探讨Akt2/Bad信号通路在NSCLC中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌细胞株SPC-A1、肺癌细胞株(淋巴结转移)NCI-H292、人高转移大细胞肺癌细胞株NCI-H460、人肺腺癌细胞株NCI-H1299、肺鳞癌细胞株SK-MES-1，以上细胞株购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；慢病毒载体及包装系统载体pLOV.UBC. EGFP载体、膜蛋白外壳质粒和反式包装质粒三种质粒购于纽恩(上海)生物科技有限公司；Enhanced infection solution(ENI．S)、polybrene、含无义序列的shRNA及绿色荧光蛋白(GFP)标记对照慢病毒载体、小干扰序列和引物购于上海吉凯基因技术公司；2000DMEM、FBS购于hyclone；primer(R&F)、Trizol、Lipofectamine、positive clone 测序及逆转录试剂盒购于Invitrogen公司；BamHI、EcoRI等限制性内切酶购于New England Biolabs；SYBR TAQ Real-time试剂盒购于Bio-Rad公司；质粒抽提试剂盒购于Qiagen公司；Cell Counting kit-8 (CCK-8)购于Dojindo公司；V-APC/7AAD、蛋白抽提试剂盒购于南京凯基生物科技公司，BCA protein assay kit购于Pierce公司；兔抗人AKT2抗体、抗兔二抗购于 Cell Signaling Technology；Luminata Western HRP substrate、PVDF膜购于Millipore公司；预染蛋白Marker购于Fermentas公司。

1.2 制备实验所用NSCLC细胞株 制备稳定干扰Akt2表达的同时稳定过表达Bad基因的NSCLC细胞株(Akt2+Bad)，具体方法详见课题组之前的研究[7-9]。

1.3 实验分组 未感染慢病毒载体的H1299、H292、SPC-A1、H460及SK-MES-1细胞为NSCLC组。阴性对照病毒转染NSCLC细胞为NC组； shAkt2组：稳定干扰Akt2的NSCLC细胞；Bad组：稳定过表达Bad的NSCLC细胞；shAkt2+Bad组：稳定干扰Akt2表达同时稳定过表达Bad基因的NSCLC株。

1.4 Western blot检测蛋白水平 根据凯基生物蛋白抽提试剂盒操作说明抽提细胞蛋白。经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，120 V恒定电压转膜，封闭过夜，Akt2一抗、Bad一抗工作浓度1∶1000，二抗工作浓度1∶5000，β-actin一抗工作浓度1∶10 000，二抗工作浓度1∶10 000。采用Millipore公司Luminata Crescendo Western HRP substrate显色液孵育3 min，放入暗盒(感光时间根据荧光条带的强弱来判定)曝光，取出X光片，放入自动洗片机显影定影后用柯达扫描仪将条带扫描至电脑保存。Quantity one分析软件测定条带灰度。

1.5 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化收集各组细胞。用PBS洗涤细胞2次(2000 rpm离心5 min)收集1～5×105细胞。加入500 μL的Binding Buffer重悬细胞。加入5 μL Annexin V-APC混匀后，加入5 μL 7-AAD染液，混匀。室温、避光、反应5～15 min。在1 h内进行流式细胞仪的观察和检测。激发波长633 nm，最大发射波长660 nm，Annexin V-APC的红色荧光使用FL4通道检测；激发波长Ex=546 nm；发射波长Em=647 nm，7-AAD红色荧光使用FL3通道检测。

1.6 细胞成瘤能力检测 准备雌雄各半、5～8周及体重匹配裸鼠18只，每组6只，SPF级环境饲养。各组细胞常规培养，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤两次，PBS重悬。调整细胞浓度，每100 μL约含1×106细胞。无菌操作下，按2×106细胞/只比例，将已制备的细胞悬液经皮下注射于裸鼠的右侧背部，观察细胞成瘤能力。4周后，摘除瘤体，称重、采集照片，将每个瘤体组织分成两部分，一部分10%福尔马林固定，石蜡包埋，另一部分-80℃冻存。

1.7 Tunel细胞凋亡检测 使用红色荧光素(Tetramethylrhodamine，TRITC)标记凋亡细胞中断裂DNA的3-OH末端，并用荧光显微镜检测。石蜡切片按常规方法脱腊，用二甲苯60 ℃浸洗5 min×2次。梯度乙醇各浸洗1次，每次3 min。1×PBS漂洗3次，每次5 min。0.1%Triton X-100处理8 min。PBS洗两遍。取出100 μL Label Solution用于阴性对照；阳性对照使用1500 U/mL Dnase I于15～25℃处理10 min，使DNA断裂。每个样本加入50 μL TUNEL reaction mixture，阴性对照加入50 μL label solution。置于湿盒中防止干燥，37°C避光孵育60 min。PBS洗3遍。50 μL DAPI复染核10 min，PBS洗3遍。抗荧光淬灭剂联合中性树脂封片。10 min后荧光显微镜检测：激发波长543 nm，发射波长571 nm(红)。DAPI最大吸收波长为358 nm，最大发射波长为461 nm。Image pro plus 6.0软件计数细胞。

2 结果

2.1 各组Bad、Akt2的蛋白水平的比较 shAkt2+Bad组Bad蛋白水平表达显著高于NSCLC组和NC组(均P<0.05)。Akt2蛋白水平表达显著低于NSCLC细胞组和NC组(均P<0.05),见图1。

2.2 对体外体内细胞凋亡和细胞成瘤能力的影响

2.2.1 体内实验 shAkt2+Bad组组织切片TUNEL染色与NSCLC、NC、Bad、shAkt2组相比，凋亡细胞数明显增加(P<0.05)，这与体外Annexin V/7-AAD流式分析结果一致，见图2A、图3。提示沉默Akt2基因表达与过表达Bad在促进肺癌细胞凋亡方面具有协同作用。

2.2.2 体外实验 shAkt2+Bad组的细胞凋亡率明显高于NSCLC、NC、shAkt2和Bad组细胞(P<0.05)，说明靶向沉默Akt2、Bad过表达在对NSCLC细胞凋亡的影响方面存在协同作用。而NSCLC与NC 组凋亡率相比差异无统计学意义(P>0.05),见图2B。说明慢病毒载体本身不会影响NSCLC的凋亡。

图1 Western blot分析3组细胞Bad蛋白及AKT2蛋白表达水平

2.2.3 细胞成瘤实验 4周后shAkt2+Bad组移植瘤重量较NSCLC、NC、Bad及shAkt2组明显降低(P<0.05)，而NSCLC及NC组重量比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2C、D。说明靶向沉默Akt2、Bad过表达在对抑制NSCLC细胞成瘤能力的影响存在协同作用，且慢病毒载体本身不会影响NSCLC的成瘤能力。

2.3 对凋亡相关蛋白的调节机制 shAkt2+Bad组瘤体组织中shAkt2蛋白表达水平明显下降，Bad蛋白表达水平明显升高(图4A)，提示转染双病毒的NSCLC细胞构建的瘤体组织中， Akt2蛋白稳定沉默且Bad蛋白稳定过表达。与NSCLC及NC组比较，shAkt2细胞株中Caspase-9蛋白表达显著下调，cyto-c显著升高(均P<0.05)，而BCL-2和BCL-XL蛋白表达水平均无明显差异(P>0.05)；与NSCLC及NC组比较，Bad组细胞株中cyto-c显著升高(P<0.05)，而Caspase-9、BCL-2和BCL-XL蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)；与NSCLC及NC组比较，Bad+shAkt2组中Caspase-9蛋白表达显著下调，cyto-c显著升高(均P<0.05)，且cyto-c的增高程度强于Bad和shAkt2组(P<0.05)(图4B)。

图2 靶向沉默Akt2、Bad过表达对体外体内细胞凋亡和细胞成瘤能力的影响

图3 各细胞组移植瘤组织内的细胞凋亡水平(×200)

3 讨论

Akt/Bad信号通路在肿瘤和非肿瘤领域的作用逐渐得到证实：Zhang等[10]发现黄杨酮能抑制Akt/p70s6k1通路，下调Bcl-2家族抗凋亡蛋白表达，上调促凋亡蛋白Bad表达，使Caspase3裂解活化，细胞色素C从线粒体释放到细胞质，从而促进凋亡；在非肿瘤领域， Quan等[11]在弓形虫感染模型中发现，弓形虫感染激活PI3K-PKB/Akt，使Bad磷酸化，抑制宿主细胞凋亡，而用PI3K抑制剂LY294002 和渥曼青霉素能阻止寄生虫诱导的PKB/Akt磷酸化，促进宿主细胞凋亡。李爽等[12]研究发现藻蓝蛋白能够通过细胞周期S期阻滞,调控细胞周期,凋亡和迁移相关基因的表达而抑制非小细胞肺癌H1299细胞的生长和迁移,进而诱导细胞凋亡。但Akt/Bad信号通路是否参与，以何种形式参与NSCLC的发病目前还鲜有报道。

图4 Western blot检测下游分子

细胞色素c(cyto-c)是线粒体呼吸链的重要组成部分，研究表明细胞凋亡的一个关键步骤是细胞色素C 从线粒体释放。释放到细胞质中的cyto-c 在dATP 存在的条件下能与凋亡蛋白酶活化因子1(apoptosis protease activating factor 1，Apaf-1) 结合形成多聚体，并使含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-9)与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，并激活其他caspase如caspase-3等，促进细胞凋亡[13-14]。本研究体内、体外实验发现，靶向沉默Akt2联合Bad过表达，较单一过表达Bad或敲出Akt2细胞凋亡率明显增加，提示Akt2/Bad信号通路可能以促进凋亡的形式参与NSCLC发病机制。在对凋亡信号通路相关蛋白表达的检测中，本研究结果显示，Akt2靶向沉默和Bad过表达的NSCLC细胞cyto-c显著升高，共感染的NSCLC cyto-c也显著升高，且cyto-c升高的程度大于单病毒感染组。因此，我们的研究提示Akt2/Bad信号通路可能通过线粒体途径调节NSCLC细胞凋亡。但与公认的线粒体促凋亡途径可能矛盾的是，我们的结果显示，靶向沉默Akt2能使caspase-9明显减少。我们采用的caspase-9抗体仅检测细胞总caspase-9含量，有必要在后续的研究中做相关的活性鉴定。

通常情况下，Bad与14-3-3蛋白结合，以磷酸化的失活形式存在于细胞质中，抑制细胞凋亡[15]。外来凋亡信号刺激激活Bad上游信号蛋白，诱导Bad去磷酸化，与BCL-2和BCL-XL结合形成异源二聚体，从而促进细胞凋亡[16]。我们在对凋亡信号通路相关蛋白的检测中发现，沉默Akt2及Bad过表达后，虽然能促进NSCLC凋亡，但BCL-2和BCL-XL的含量均无明显变化，提示调节Akt2及Bad可能只是影响BCL-2和BCL-XL的聚合及解聚而不会改变上述蛋白的总量，或者可能在NSCLC中，凋亡调节并不主要通过上述途径。另外我们发现，靶向抑制Akt2也不会改变其下游蛋白Bad的含量，提示Akt并不依靠改变Bad剂量来调控它的活性。

Chorner等[17]研究发现Akt-1抑制剂a-674563相对于泛Akt抑制剂mk-2206，在降低NSCLC细胞存活率方面更有效。Akt1的缺失可抑制肺癌的发展，而Akt2的缺失则促进了肺癌的发展。p-Akt2是Akt2磷酸化的活性形式。但本研究组既往的研究[18]发现， p-Akt2阳性患者5年生存率明显降低，而p-Akt1与预后无关，推测在NSCLC肿瘤进展中，Akt2发挥更重要的作用。本次研究体内、体外实验再次证实，靶向沉默Akt2能够促进NSCLC的凋亡，抑制NSCLC细胞株在裸鼠体内成瘤。

研究[19]发现，miR-137过表达抑制了顺铂作用下的A549和 H520细胞的Akt2蛋白的表达，增加了caspase-3活性，增加了bax 蛋白的表达，并抑制了cyclin d1蛋白的表达。Akt2抑制剂mk2206可抑制akt2蛋白的表达，抑制顺铂诱导的A549和H520细胞增殖。Akt2的抑制还可以增加caspase-3活性和bax蛋白的表达，该研究结果间接证实了Akt2信号通路在肺癌细胞增殖和凋亡中的作用，并提示这一发现可以转化为抗癌耐药机制的研究。

本研究提示，Akt2/Bad信号通路可能通过线粒体途径参与NSCLC的凋亡，参与NSCLC的发病机制，此外还有多种蛋白构成相当复杂的信号网络参与其中。今后我们将会聚焦在这些网络中寻找关键环节及调控点，并将其转化为抗癌靶向药物的研发和抗癌药物耐药机制的研究。

4 结论

靶向沉默Akt2联合Bad过表达在促进NSCLC细胞凋亡方面有协同作用,能显著增加cyto-c表达，下调caspase-9的表达；Akt2/Bad信号通路可能通过线粒体途径促进细胞凋亡参与NSCLC的发病机制。