硫喷妥钠调控miR-664-1-5p对氯化钴诱导的心肌细胞缺氧损伤的保护作用*

许明星 郑传东 杨鹏 杨娜

(成都市第三人民医院 1.麻醉科；2.病理科，四川 成都 610031)

心肌缺血是指心脏的血液灌注减少导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态；心肌缺血与多种心血管疾病的发生、发展密切相关，严重危害人类身体健康[1-2]。研究[3]表明麻醉药对心肌细胞损伤具有保护作用，如七氟醚对心肌具有保护作用；丙泊酚可减轻高糖缺氧对心肌细胞的损伤[4]。硫喷妥钠可减轻缺血后大鼠海马脑片神经元的损伤[5]，也可减轻再灌注心律失常[6]，但具体机制尚不清楚。miRNAs在心血管系统疾病如心肌梗死、肥大、纤维化、心力衰竭、心律失常、炎症和动脉粥样硬化等病变组织中有差异表达，可能影响疾病的进程[7-8]。研究[9]显示，miR-664-1-5p在缺氧预处理大鼠心肌细胞中表达水平降低，可能参与缺氧介导的心肌细胞保护作用。基于以上研究结果，本研究假设，硫喷妥钠通过调控miR-664-1-5p在缺氧大鼠心肌细胞损伤中发挥保护作用。本课题以大鼠心肌细胞H9c2为研究对象，建立氯化钴(CoCl2)缺氧模型，研究硫喷妥钠对CoCl2诱导的H9c2细胞存活、凋亡的作用，及miR-664-1-5p在该保护机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠心肌细胞H9c2购自北京北纳创联生物技术研究院，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，硫喷妥钠、氯化钴(CoCl2)、胰蛋白酶、购自Sigma-Aldrich公司，BCA蛋白检测试剂盒和CCK8检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司，丙二醛(malondialdehyde,MDA) 和超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD) 检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，miR-664-1-5p的模拟物(miR-664-1-5p)、miR-664-1-5p的干扰物(anti-miR-664-1-5p)、阴性对照(miR-NC、anti-miR-NC)和引物购自上海吉玛制药有限公司，Total RNA提取试剂盒、 real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自宝生物工程(大连)有限公司，P21、Caspase-3和GAPDH抗体购自英国Abcam公司，流式细胞仪购自BD公司，Real-time PCR仪购自美国Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将H9c2细胞接种在含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2恒温密闭培养箱中培养，待生长至对数生长期时，洗涤消化传代。

1.2.2 细胞氯化钴缺氧模型构建和实验分组 氯化钴模型建立：根据文献[10]的方法，将对数生长期的H9c2以1×104个细胞/孔接种于96孔板中，培养至细胞融合度达到80%左右时，弃培养液，加入含终浓度600 μmol/LCoCl2的DMEM培养液培养12 h即为模型组，对照组加入不含CoCl2的DMEM培养液培养12 h。将缺氧模型组细胞继续培养4 h后，加入含硫喷妥钠终浓度125、250、500 nmol/L的DMEM培养液，置于37 ℃ 5%、CO2恒温密闭培养箱中培养30 min，根据浓度分别分为药物1、2、3组。

1.2.3 CCK8法测定细胞存活率 将对数生长期的H9c2以1×l04个细胞/孔接种于96孔板中，培养至细胞融合度达到80%时加入含600 μmol/L CoCl2培养液培养12 h建立模型组，加入10 μLCCK8溶液，培养2 h后于450 nm处测定吸光度(A)值。细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。

1.2.4 流式细胞术测定细胞存活率和凋亡率 收集培养好的各组H9c2细胞，PBS缓冲液洗涤2次，稀释细胞浓度为1×106个/mL，根据凋亡试剂盒说明书进行操作，取100 μL Binding buffer重悬细胞，然后加入5 μL膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和10 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，室温避光20 min，流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.2.5 Western blot检测P21和Caspase-3凋亡相关蛋白水平 收集培养好的各组H9c2细胞，裂解细胞，收集蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，进行SDS-PAGE，转膜，室温封闭2 h，加入一抗(P21抗体1∶1000，Caspase-3抗体1∶1000，GAPDH抗体 1∶2000)，4 ℃孵育过夜，PBST洗膜2次，加入稀释的二抗,室温孵育2 h，分析蛋白水平，以GAPDH为内参照。

1.2.6 细胞转染 将对数生长期的H9c2细胞，以每孔2×l05个细胞接种于6孔板中，细胞融合为一层时进行转染，用无血清OptiMEM培养液稀释Lipofectamine 2000、miR-664-1-5p、miR-NC、anti-miR-NC、anti-miR-664-1-5p，分别记为miR-664-1-5p组、miR-NC组、anti-miR-NC组、anti-miR-664-1-5p组，将各组载体转染入培养好的细胞中，培养6 h后换成完全培养液，转染48 h，进行后续实验。

1.2.7 Real-time PCR检测miR-664-1-5p的表达水平 收集模型组、加药组和/或转染的各组H9c2细胞，用试剂盒提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，取cDNA按照 Real-time PCR的说明书进行反应检测miR-664-1-5p的含量。用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

2 结果

2.1 硫喷妥钠对CoCl2诱导的心肌细胞的细胞存活率和凋亡的影响 与对照组相比，模型组心肌细胞H9c2中P21和Caspase-3含量升高，细胞存活率降低，凋亡率升高(P<0.05)；与模型组相比，药物2组和药物3组H9c2细胞P21和Caspase-3含量降低，细胞存活率升高，凋亡率降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图1和表1。

图1 凋亡及P21、Caspase-3蛋白的表达

表1 硫喷妥钠对CoCl2诱导的心肌细胞的细胞存活率和凋亡的影响

2.2 硫喷妥钠对CoCl2诱导的心肌细胞中miR-664-1-5p、SOD、MDA表达的影响 与对照组相比，模型组H9c2细胞中miR-664-1-5p含量下降(P<0.05)，MDA含量增多(P<0.05)，SOD活性降低(均P<0.05)；与模型组相比，药物2组和药物3组H9c2细胞的miR-664-1-5p含量升高，细胞中MDA含量减少，SOD活性升高(均P<0.05)，见表2。提示CoCl2可诱导心肌细胞miR-664-1-5p含量降低，抗氧化能力减弱；硫喷妥钠可减轻CoCl2诱导的心肌细胞H9c2损伤，提高心肌细胞的抗氧化能力。综上，后续实验选择药物3组浓度进行。

表2 硫喷妥钠对CoCl2诱导的心肌细胞中miR-664-1-5p、SOD、MDA表达的影响

2.3 过表达miR-664-1-5p对CoCl2诱导的心肌细胞的细胞存活率和凋亡及SOD、MDA的影响 Westernblot和流式细胞术结果显示，与miR-NC组相比，miR-664-1-5p组H9c2细胞中miR-664-1-5p含量升高，细胞存活率升高，凋亡率降低，细胞中MDA、P21和Caspase-3含量减少，SOD活性升高(均P<0.05)，见图2和表3。

2.4 抑制miR-664-1-5p能减弱硫喷妥钠对CoCl2诱导的心肌细胞的细胞存活率和凋亡的影响 与anti-miR-NC组相比，anti-miR-664-1-5p组的miR-664-1-5p含量降低，细胞存活率降低，凋亡率升高，细胞中P21和Caspase-3含量增多，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图3和表4。

图2 凋亡及P21、Caspase-3蛋白的表达

表3 过表达miR-664-1-5p对CoCl2诱导的心肌细胞的细胞存活率和凋亡及SOD、MDA的影响

图3 凋亡及P21、Caspase-3蛋白的表达

表4 抑制miR-664-1-5p能减弱硫喷妥钠对CoCl2诱导的心肌细胞的细胞存活率和凋亡的影响

2.5 抑制miR-664-1-5p能减弱硫喷妥钠对CoCl2诱导的H9c2细胞中SOD、MDA的影响 与anti-miR-NC组相比，anti-miR-664-1-5p组的H9c2细胞中MDA含量增多，SOD活性降低，差异均具有统计学意义(均P<0.05)，见表5。

表5 抑制miR-664-1-5p能减弱硫喷妥钠对CoCl2诱导的心肌细胞中SOD、MDA的影响

3 讨论

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)及时进行再灌注治疗恢复缺血心肌的血液供应，被认为是阻止心肌坏死最有效的治疗手段，但其又会引发心肌缺血再灌注损伤[11-12]。减少心肌细胞凋亡是减轻心肌损伤的重要途径之一[13-14]。研究[15]表明，硫喷妥钠等麻醉剂可能通过钙钾通道电流减轻心肌缺氧损伤。miRNA可与心肌细胞损伤的过程，且miRNA在胎儿心肌细胞、心脏成熟和成人心脏病中均发挥调节作用，可能是促进损伤后心脏修复的有价值靶点[16-17]。韩正怡[18]发现，miR-664-1-5p在吗啡预处理的缺氧/复氧H9c2心肌细胞中表达减少。miR-664-1-5p在缺氧预处理和吗啡预处理的慢性心力衰竭模型细胞中也表达下调，可能通过调节靶基因Fas在吗啡预处理的心脏保护作用中起着重要作用[9]。

SOD是细胞内氧自由基清除剂，可降低细胞内的氧化应激水平[19]；MDA是脂质过氧化物的终产物，其水平可间接反映细胞氧化损伤程度[20]。本研究通过建立大鼠心肌细胞H9c2的CoCl2化学缺氧模型，检测发现，H9c2经CoCl2化学缺氧处理后，细胞存活率降低，凋亡率升高，SOD含量降低，MDA及P21和Caspase-3蛋白含量升高；miR-664-1-5p在CoCl2处理后的H9c2细胞中表达下降，与上述研究结果一致。模型组H9c2细胞经过125、250、500 nmol/L的硫喷妥钠处理后，细胞中miR-664-1-5p水平升高，细胞存活率升高，凋亡率降低，SOD含量升高，MDA含量降低。

为了确认硫喷妥钠通过miR-664-1-5p发挥对缺氧H9c2细胞存活和凋亡的调控作用，转染实现过表达和抑制miR-664-1-5p。本研究发现，过表达miR-664-1-5p可抑制CoCl2诱导的H9c2细胞凋亡，提高细胞存活率，提高SOD含量，降低MDA及P21和Caspase-3蛋白含量；抑制miR-664-1-5p则结果相反，减弱硫喷妥钠对CoCl2诱导的心肌细胞的细胞存活率、凋亡及细胞中SOD和MDA含量的影响。

4 结论

硫喷妥钠可能通过上调miR-664-1-5p在CoCl2诱导的大鼠心肌H9c2细胞损伤中发挥保护作用，抑制细胞凋亡，提高细胞存活率，减轻细胞损伤，对心肌细胞缺氧损伤具有潜在的保护作用。