天麻素对焦虑样胃高敏感性功能性消化不良模型大鼠脑胃调节因子含量的影响*

景富春 景璇 张军 王进海 冯 胡浩 孙晓明 郑建云 尹晓然

(1. 西安交通大学第二附属医院消化内科·陕西省胃肠动力疾病研究重点实验室，陕西 西安 710004；2.延安大学附属宝鸡市人民医院消化内科，陕西 宝鸡 721000；3.石河子大学医学院临床医学专业2018级3班，新疆 石河子 832000；4.西安交通大学医学部药理学系，陕西 西安710068；5.西安交通大学医学部基础医学实验教学中心，陕西 西安 710068；6.西安医学院第一附属医院病理科，陕西 西安 710077)

功能性消化不良(functional dyspepsia, FD)是以胃十二指肠症状如上腹胀、上腹痛、早饱及上腹烧灼感等为主而又排除器质性病变的一种临床综合症，胃敏感性增高(gastric hypersensitivity, GHS)是其出现上述症状的主要病理生理改变和特征性发病机制之一[1]，也是FD治疗效果差且易于复发的重要原因。焦虑是临床常见的精神心理障碍， 在FD患者中发生率高达40%～90%[2]，其通过影响人体的神经体液调节对FD的发生发展产生重要作用，是GHS形成的关键诱因之一。一些神经调节因子如5羟色胺(5-HT)[3]、γ-氨基丁酸(GABA)[4]、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)[5]和nesfatin-1[6-7]等同时参与了焦虑抑郁等精神心理活动和胃感受性等内脏感觉的调节，是FD患者脑和胃共有的神经生化调节物质，其在脑、血液和胃组织内的含量变化对伴焦虑症状并以GHS为主要病理生理改变的FD患者具有显著影响。天麻素(gastrodin, Gas)是从中药天麻中提取的一种有效成分，具有抗焦虑、镇静催眠及治疗神经衰弱等作用[8]，对脑缺血再灌注损伤大鼠纹状体内的GABA[9]、损伤后脊髓中的BDNF[10]及慢性轻度应激大鼠脑内5-HT等单胺类神经递质有调节作用[11]。我们将Gas试用于临床FD患者，发现其对FD伴随的焦虑和上腹痛等消化不良症状有一定改善作用[12]。然而，Gas是否通过影响脑胃共有的神经生化调节因子产生上述作用尚不清楚。我们前期已利用神经药理学方法和消化病学造模技术，成功建立了焦虑样GHS大鼠FD模型[13]，并应用该模型初步观察了Gas对大鼠焦虑样行为和胃敏感性的作用[1]。在此基础上，本研究拟通过观察天麻素对大鼠海马、胃壁及血浆中5-HT、GABA、BDNF和nesfatin-1含量变化的影响，探讨其调节FD大鼠焦虑症状和GHS的机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 40只1日龄SPF级雄性Sprague-Dawley仔鼠，体质量3～5 g，购自第四军医大学实验动物中心，生产许可证号SCXK(陕)2014-002。随机分为5组：对照组、模型组、丁螺环酮组、Gas小剂量组和Gas大剂量组，每组8只。母婴同笼饲养于西安交通大学医学部机能实验中心，室温(24±1)℃，相对湿度(50±20)%，按12:12小时明暗循环，母鼠自由进食和饮水。研究经西安交通大学伦理委员会批准。

1.2 试剂和仪器 碘乙酰胺(iodoacetamide，IA)购自上海麦克林公司，蔗糖购自国药集团，戊巴比妥钠购自德国Merck公司，5羟色胺(5-HT)、γ氨基丁酸(GABA)、脑源性神经营养因子(BDNF)和nesfatin-1酶联免疫吸附试验试剂盒购自上海闳巨公司。Gas购自昆明制药集团公司(批号：国药准字H20013046)，丁螺环酮购自江苏恩华药业股份有限公司(批号：国药准字H19991024)。酶标仪为美国Molecular Devices (VERSAmax)公司生产。

1.3 造模方法和给药

1.3.1 母婴分离法[14]对照组母婴同笼常规饲养。其余各组乳鼠自出生后第2日起，每日与母鼠分离3小时，时间为上午9∶00～12∶00，至第21日结束。所有幼鼠自出生后第22日断奶，与母鼠完全分离，单笼饲养至生后第8周进入束缚应激试验。

1.3.2 急性胃应激法[15]接受母婴分离的乳鼠于出生后第10日起，每日采用含0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液灌胃0.2 mL，对照组仅用等容积2%蔗糖溶液灌胃，连续6天。

1.3.3 束缚应激法[16]经母婴分离和急性胃应激实验发育而成的大鼠，于出生后第8周接受束缚应激试验。每只大鼠每日被置于自制的长15 cm、直径6 cm通风良好的塑料圆筒束缚应激装置内，持续90 min后放回原笼，连续1周。

1.3.4 给药 于第8周束缚应激试验结束后，立即开始腹腔内注射给药，每天1次，连续7天。其中对照组和模型组分别给予等容积0.9%氯化钠溶液2.0 mL/kg，Gas小剂量组和大剂量组分别给予Gas 62.5 mg/kg和125 mg/kg，丁螺环酮组给予丁螺环酮 3.125 mg/kg。

1.4 脑、胃相关神经调节因子检测 第8周束缚应激试验结束后，每只大鼠适应性饲养1周，然后在戊巴比妥钠麻醉下，采尾静脉血1.0 mL，3000 rpm离心15 min后取上清液300 μL，置于-80℃冰箱保存，择日测定。采血后大鼠被迅速断头处死，取脑并分离海马、取胃体部组织块，匀浆器制作海马及胃组织匀浆，3000 rpm低温离心30 min后取上清液，分别置于-80℃冰箱保存待测。样品中5-HT、BDNF、GABA和nesfatin-1等的含量测定均采用ELISA法，测定日按照试剂操作说明书进行测定。

2 结果

2.1 天麻素对焦虑样胃高敏感性FD模型大鼠海马、胃和血浆中5-HT含量的影响 模型组大鼠海马、胃和血浆中5-HT的浓度均低于对照组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，Gas小剂量组、Gas大剂量组和丁螺环酮组各部位5-HT浓度均明显增加(P<0.01)，且不同部位间5-HT浓度呈现同步变化趋势，见图1。表明天麻素可对模型大鼠不同部位5-HT含量产生影响。

图1 各组大鼠海马、血浆和胃组织内5-HT含量

2.2 天麻素对焦虑样胃高敏感性FD模型大鼠海马内GABA含量的影响 模型组大鼠海马内GABA的浓度低于对照组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比， Gas小剂量组、Gas大剂量组和丁螺环酮组海马内GABA浓度明显增加(P<0.01)，见图2。提示天麻素可通过影响脑内GABA含量产生相应作用。

2.3 天麻素对焦虑样胃高敏感性FD模型大鼠海马、胃和血浆中BDNF含量的影响 模型组大鼠海马、胃和血浆中BDNF的浓度均低于对照组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，Gas小剂量组、Gas大剂量组和丁螺环酮组各部位BDNF浓度均明显增加(P<0.01)，且不同部位间BDNF浓度呈现同步变化趋势，见图3。提示天麻素亦可通过影响BDNF发挥调节焦虑样行为和胃敏感性的作用。

图2 各组大鼠海马内GABA含量

图3 各组大鼠海马、血浆和胃组织内BDNF含量

2.4 天麻素对焦虑样胃高敏感性FD模型大鼠海马、胃和血浆中nesfatin-1含量的影响 模型组大鼠海马、胃和血浆中nesfatin-1的浓度均高于对照组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比， Gas小、大剂量组和丁螺环酮组各部位nesfatin-1浓度均明显下降(P<0.01)，且不同部位间nesfatin-1浓度呈现出同步变化的趋势；但Gas的作用未表现出明显量效关系，见图4。表明海马、胃和血浆中的nesfatin-1也是天麻素作用靶点之一。

图4 各组大鼠海马、血浆和胃组织内nesfatin-1含量

3 讨论

Gas是天麻中的一种有效成分，具有抗焦虑、镇静催眠及治疗神经衰弱等作用[8]，可提高脑缺血再灌注损伤大鼠纹状体内的GABA[9]、损伤后脊髓中的BDNF[10]及慢性轻度应激大鼠脑内5-HT等神经活性物质的含量[11]，但其是否对焦虑样胃高敏感FD模型大鼠海马、胃和血浆中的前述脑胃共有神经调节因子产生影响尚不清楚。本研究通过将Gas用于焦虑样胃高敏感FD模型大鼠，初步证实了Gas对模型大鼠海马、胃及血浆中的5-HT、BDNF、GABA和nesfatin-1含量具有调节作用。

脑内5-HT能神经元突触前膜对5-HT的释放减少或突触间隙内5-HT的浓度降低可引起焦虑样情绪和行为，而抑制突触前膜对5-HT的再摄取、增加突触间隙中5-HT的浓度则能使焦虑障碍减轻[5,17]。但尚不清楚海马及胃黏膜内5-HT受体的具体种类、分布及作用，也不明确脑、胃和血液中5-HT变化是否存在一致性。目前仅知胃肠道主要有5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4、5-HT7五种受体亚型，其中5-HT2、5-HT3、5-HT4受体可介导胃肠道平滑肌收缩[3]，5-HT1、5-HT7受体则介导胃肠道平滑肌松弛[18]。本研究发现焦虑样GHS模型组大鼠海马、血浆和胃组织内的5-HT水平较对照组明显降低，且具同步性，提示上述三个部位的5-HT均参与了模型大鼠焦虑及消化不良症状的形成。Gas小剂量组、Gas大剂量组和丁螺环酮组大鼠三个部位的5-HT含量则均明显高于模型组，表明Gas和丁螺环酮均有提高海马、血浆和胃组织内5-HT含量，从而改善焦虑样GHS模型大鼠的焦虑行为和FD症状的作用。

GABA是一种中枢抑制性递质，缺乏时人和动物会表现出焦虑、失眠、情绪激动等精神心理反应。焦虑状态下动物由于海马内缺乏GABA或GABA受体可致内脏痛阈降低、内脏痛觉及敏感性增加[4]。本研究显示，在焦虑样GHS模型大鼠海马内GABA的含量明显减少。而Gas小剂量组、Gas大剂量组和丁螺环酮组大鼠海马内GABA含量则较模型组明显升高，表明Gas和丁螺环酮均可通过调节海马内GABA浓度而产生一定的抗焦虑和调节内脏敏感性作用。

BDNF是脑内含量最多的神经营养因子，其不仅与GABA能神经功能的维持有关，而且参与了焦虑的形成。海马区BDNF表达下降或基因敲除后，动物表现出明显的焦虑情绪与行为，而向相应脑区注射BDNF则有利于缓解焦虑状态。有研究[5]还揭示某些部位BDNF的含量变化尚与胃和结肠的敏感性呈正相关关系。本研究发现焦虑样GHS模型FD大鼠海马、血清和胃内的BDNF含量同步性减少，与前述研究结果部位不同、结论不完全一致。推测在这一模型大鼠体内BDNF参与了焦虑样精神心理和行为的调节，但对胃敏感性的调节则不是单一因素，而是受到其他几种生物活性分子的共同作用。本实验结果显示Gas对焦虑样GHS模型FD大鼠海马、血清和胃内的BDNF含量均有升高作用，丁螺环酮亦表现出相似的作用，提示Gas可以通过影响BDNF而影响焦虑样GHS模型大鼠的脑胃生物学行为。

Nesfatin-1是一种肽类激素，具有抑制摄食和诱导焦虑反应的作用[19]。神经性厌食症伴焦虑患者血浆中的nesfatin-1浓度升高[6]，而脑室内注射nesfatin-1可使胃排空延迟[20]。nesfatin-1尚可影响内脏感觉、增加内脏敏感性[7]。本研究结果显示焦虑样GHS模型FD大鼠海马、血清和胃内的nesfatin-1含量明显增多，推测其为伴焦虑症状GHS的FD患者脑胃轴的重要调节激素之一。与之相比较，Gas组可明显下调海马、血浆和胃组织内nesfatin-1的含量，这一作用与丁螺环酮类似，提示Gas本身具有影响中枢和外周相关部位nesfatin-1水平，进而影响实验动物精神心理和胃敏感性的双重作用。

4 结论

Gas能明显增加序贯应激所致焦虚样胃高敏感FD模型大鼠海马、血浆和胃组织中的5-HT、BDNF、GABA的含量，减少nesfatin-1的含量。