滇池金线鲃视顶盖组织学观察

和 友，王晓爱，潘晓赋，杨君兴

(1.中国科学院 上海高等研究院 上海光源科学中心, 上海 201204; 2.中国科学院 昆明动物研究所 遗传资源与进化国家重点实验室 云南省高原鱼类育种重点实验室, 云南 昆明 650223)

金线鲃属是我国特有的鲤科鱼类，分布于我国西南喀斯特地区地下暗河及与之相连的水体中.至今已有超过60种金线鲃鱼类被报道[1].分子系统发育研究显示：金线鲃属与鲫属、鲤属、原鲤属、须鲫属、似鱤属构成一个单系群[2].该属鱼类中一半为典型洞穴鱼类，表现出视觉退化、体色白化等表型，其基因组和转录组水平变化机制不同于国际上所用的脂鲤科洞穴鱼墨西哥丽脂鲤[3-5]，是研究退行性演化的新模型.头部结构是鱼类比较解剖学研究的重要内容之一[6]: 一方面头部是全身骨骼最复杂组合之处，包含了丰富的分类与进化信息；另一方面，对头部所在的眼、嗅囊、内耳等感觉器官以及脑的比较解剖有助于认识其对洞穴环境的感觉适应.二十世纪八九十年代，我国学者曾对当时已知的少数金线鲃物种的体鳞形态、围眶骨系等特征进行过描述[7-9]，但对金线鲃鱼类的脑结构的研究迄今尚未见报道.滇池金线鲃是金线鲃属鱼类的旗舰物种，其全基因组测序已经完成[4]，并已成功实现人工繁殖[10].滇池金线鲃具有正常发育的眼，对其脑结构的研究，可作为该属鱼类神经系统比较解剖的基础.作者基于同步辐射显微CT方法对金线鲃颅脑结构开展了3维无损研究，获得相关物种头部骨骼、脑大体形态、耳石结构等信息[4,11].新近，利用显微光学切片断层成像(Micro-Optical Sectioning Tomography, MOST)技术，我们完成了一套基于Nissl染色的滇池金线鲃亚微米分辨率的3维脑图谱，为开展金线鲃属鱼类的脑结构和功能研究提供了一套比对标准.

本文对滇池金线鲃中脑视顶盖结构进行报道.视顶盖是硬骨鱼类中脑背侧的一对显著的解剖结构(又称作视叶)，是重要的视觉中枢，主要接受对侧视神经的纤维投射，具有明显的分层结构(lamination).显微光学切片断层成像以1μm步长对染色后的脑进行自动连续切片和图像采集，通过高精度配准后获取亚微米精度的全脑3维图谱.我们基于MOST技术对Nissl染色的滇池金线鲃视顶盖3维复原后进行组织学观察，并参照鲫鱼视顶盖Bodian(蛋白银)染色结果[12]识别其分层结构，探讨了相关的解剖学名词，为后继相关脑区的功能与演化研究提供解剖学基础.

1 材料与方法

云南省高原鱼类育种重点实验室人工繁殖两年龄滇池金线鲃，全长10～12cm.丁香油麻醉后，断头取脑，置于4%多聚甲醛(PFA)溶液中4℃过夜后，重新更换4%PFA保存8月以上.随后进行增强型Nissl染色，由中国科学院上海药物研究所MOST及图像融合分析平台完成显微光学切片断层成像.鱼脑置于2.5%硫堇染液中染色12d，再用70%的乙醇浸泡4d脱色.随后用梯度乙醇、乙醇-丙酮(体积比1∶1)溶液、100%丙酮各浸泡2h脱水，在新的100%丙酮中过夜.将脱水后的鱼脑依次浸入50%、75%的Spurr树脂中渗透，最后在100%Spurr树脂中渗透3d，60℃烘箱内加热聚合36h后包埋.包埋后样品装MOST组织切片机，以1μm切片厚度和20×镜头条件下进行连续自动切片与图像采集；单张图像以8位jpg格式保存.所获取全套图像(image stack)导入AVIZO软件中分析观察；8位灰度图像反相处理后以蓝绿色调渲染观察；体积元素(Volume Pixel)大小为0.35μm×0.35μm×1μm.

2 结 果

通过显微光学切片断层成像，我们获取了一套滇池金线鲃的自端脑至菱脑(小脑与延脑)的脑图谱(图1).滇池金线鲃中脑解剖结构与其他鲤科鱼类大体相同：背侧为一对视叶(即视顶盖)，腹侧中脑被间脑下叶遮挡；中脑嘴端与间脑交界处通过后联合相区分；中脑本身分为背部与腹部，背部为一对视顶盖(tectum opticum)，腹部为中脑被盖(tegmentum)；左右视顶盖中线结合处下方为一对纵枕；视顶盖与被盖间具有左右脑室(tectal ventricle)；中脑尾端小脑瓣伸入视顶盖与被盖之间(图2).

图1 滇池金线鲃Nissl染色脑横切片

视顶盖从前到后覆盖整个中脑.我们选取中后段位置、背内侧部位的视顶盖进行观察(图2).经过3维重建后，可清晰辨别5条神经元胞体的聚集带(图2(b)，图3).我们以此为依据，并通过与文献报道的鲫鱼视顶盖Bodian染色结果进行比对[12]，将滇池金线鲃视顶盖由内向外划分为: 围脑室层(Stratum Periventriculare, SPV)、中央白质层(Stratum Album Central, SAC)、中央灰质层(Stratum Griseum Central, SGC)、表面灰质与纤维层(Stratum Fibrosum et Griseum Superficiale, SFGS)、边缘层(Stratum Marginale, SM).各层简介如下.

图2 (a)中脑后部经视顶盖、小脑瓣、被盖、下叶的3维复原断层(50μm厚,标尺: 1mm),(b)自(a)中ROI区域视顶盖3维复原(标尺: 150μm).

1)围脑室层(SPV): 此层位于视顶盖最内侧，与侧脑室相邻.由大约6排圆形神经元胞体紧密排列而成.Nissl染色组织切片上也极易识别(图3(c)).

图3 滇池金线鲃视顶盖分层(自图2(b)中ROI区域)

2)中央白质层(SAC): 此层最薄.其内侧与围脑室层相接，外侧边界由一层神经元胞体聚集带界定.该层神经元中有较大的锥体神经元和中等大小梭形细胞.在鲫鱼视顶盖Bodian染色结果中[12]，此层为视顶盖传出纤维所在的区域.

3)中央灰质层(SGC): 此层最厚，包含两层细胞聚集带.内侧神经元胞体聚集带位于此层中部，外侧神经元胞体聚集带形成本层的外侧边界，因此该层可分为内、外两部分.

4)表面灰质与纤维层(SFGS): 此层内侧与中央灰质层相接，外侧以整个视顶盖中最外侧神经元胞体聚集带为边界.在鲫鱼视顶盖Bodian染色结果中[12]，此层为接受对侧视神经纤维传入的主要部位.

5)边缘层(SM): 此层神经元胞体十分稀少.在鲫鱼视顶盖Bodian染色结果中[12]，此层含有大量无髓鞘神经纤维.

3 讨 论

3.1 滇池金线鲃视顶盖的分层

中脑视顶盖是鱼类的重要视觉中枢，主要接受对侧视神经的纤维投射.在辐鳍鱼类各代表类群研究中，通过Golgi染色等重金属染色、结合逆行性追踪，显示视顶盖都具有明显分层结构[12-13].Vanegas等[14]将银鲈单侧眼球摘除后，结合硝酸铀酰重金属染色，将对侧视顶盖(即摘除眼球的视神经投射侧)由内向外分为6层(stratum)(表1Ⅱ).而同侧视顶盖中(未摘除眼球的视神经投射侧)由于不存在退行性神经纤维标记，其分层结构除可识别出SPV、SAC两层外，其余各层界限并不明显.Von Bartheld等[15]基于辣根过氧化物酶(HRP)追踪标记视神经对辐鳍鱼类各代表类群的视顶盖比较研究中沿用Vanegas的6层分层模式.其结果表明视神经的主要投射部位为SFGS层，这是所有鱼类接受视神经投射的保守区域.同时不同类群的视顶盖分层存在差别，主要在于: 1)是否存在单独的视觉层(Stratum Opticum, SO); 2)SGC层是否接受视神经投射.对于鲤科鱼类而言，基于HRP的追踪标记实验中SO层与SFGS层的界限不明显[15].而Northcutt基于Bodian蛋白银染色对辐鳍鱼类视顶盖分层的研究结果与此一致[12].他将视顶盖由内向外先分为4区(zone): PGZ、DWZ、CZ、SGWZ(表1Ⅰ)；各区下再以阿拉伯数字分“带(layer)”(由于中文“层”已经用于“stratum”，我们将“layer”翻译为“带”，以免混淆).PGZ区相当于SPV层，DWZ区相当于SAC层、CZ区相当于SGC层，而SGWZ区则对应SFGS、SO、SM 3层.这样4分区的分层结构在所有辐鳍鱼类中是保守的，而对不同类群则可再以“带(layer)”进行细致划分.

表1 视顶盖分层名词

Nissl染色(及HE曙红染色)主要对神经元胞体进行着色，但无法对神经纤维着色，因此在传统Nissl染色的脑组织切片中，无法准确区分视顶盖中除SPV，SM层外的分层结构界限.本文通过MOST方法获取了基于Nissl染色的滇池金线鲃三维脑图谱.通过3维复原的视顶盖，可以清晰辨别出5条神经元胞体聚集带(图3(a)).我们以此为依据，并参照鲫鱼Bodian染色结果[12]，识别出滇池金线鲃视顶盖5层结构(图3)(表1Ⅴ)，SAC、SGC、SFGS 3层外侧边界由对应的神经元胞体聚集带清晰界定.SFGS层与SM层分界明显，但在SFGS层内神经元胞体连续分布，无法进一步区分出一个单独的SO层；这与基于Bodian蛋白银染色和HRP逆向追踪的鲫鱼视顶盖分层研究相一致[12,15].

在滇池金线鲃视顶盖各层中SGC层最厚，根据该层中部的神经元胞体聚集带3(图3(a))又可将SGC层分为内外两部分，外侧部分相当于银鲈视顶盖中的内网状层(Inner Plexiform Layer, IPL)[16].将3维复原图与对应Nissl染色组织切片图配准后，各分层结构清晰可见(图3(b)).而与之形成明显对比，在Nissl染色组织切片中，除内外两侧的SPV、SM层外，其他SAC、SGC、SFGS各层边界很难界定(图3(c)).

3.2 解剖学名词

现在，国际上基于Vanegas等的6分层结构在鱼类视顶盖的比较解剖和相关功能研究中被广泛接受，但早期不同研究者对视顶盖分层采用名词各不相同[12].国内对硬骨鱼类的视顶盖组织学研究，主要见于鲤鱼[17]、真鲷[18]、罗非鱼[19]、贝氏高原鳅[20]、宽体沙鳅[21]等.所用中文名词各有差别.秉志基于Cajal染色并参照文献[22]，将鲤鱼视顶盖分为8层[17]，第1～4层分别为室管膜与视盖深层纤维、结层、视盖联合层、视盖臂纤维层；第7层为外结层，第8层为视神经层；第5、6层未给出名称.其分层依据和所用解剖学名词，无论中英文至今已有较大变化.上世纪90年代国内研究者相继对其他硬骨鱼类视顶盖组织学进行了研究，对分层结构所用的中文名称有所不同，但外文词源(包括本研究)都来自前述Vanegas等的工作[14,16].王艺磊等[18]基于Golgi染色并依循Vanegas等(1974)对鲈形目鱼类的研究[16]，将真鲷视顶盖分为6层，中文名称由内向外分别为: 围脑室层(SPV)、中央白质层(SAC)、中央灰质层(SGC)、表面灰质及纤维层(SFGS)(原文中“灰质”打印为“灰管”)、视觉层(SO)、边缘层(SM)(表1Ⅲ).黄静等[20]在对贝氏高原鳅中脑视顶盖进行Nissl染色/HE染色组织学研究时，给出的分层结构中文名依次为: 围脑室层(SPV)、中央纤维层(SAC)、中央细胞层(SGC)、表面纤维层(SFGS)、视神经层(SO)、边缘层(SM)(表1Ⅳ).陈蓉等[19]基于HE染色对罗非鱼的研究、史晋绒等[21]基于Nissl染色/HE染色对宽体沙鳅的研究所采用的名称与此相同.

如上节所述，由于Nissl染色(和HE染色)无法对神经纤维着色，因此在基于Nissl染色标本中无法观察到神经纤维(图3(c))；若将视顶盖6分层结构表述为“神经纤维与细胞层交替排列的层状结构”则并不准确.遵循Vanegas等原始文字[14]，本文中采用“中央灰质层”代替“中央细胞层”来翻译“Stratum Greiseum Centrale”，采用“表面灰质与纤维层”代替“表面纤维层”来翻译“Stratum Fibrosum et Greiseum Superficiale”(表1Ⅴ).同时需要指出的是：尽管鱼类视顶盖中具有“视觉层(SO)”，但SO层并不是在所有鱼类中均可区分，而“表面灰质与纤维层(SFGS)”是视神经纤维投射的主要部位[15].此外，本文中采用“区”、“层”、“带”翻译视顶盖研究中相应的“zone”、“stratum”、“layer”3级结构.

致谢:显微光学切片断层成像由中国科学院上海药物研究所MOST及图像融合分析平台完成，特此致谢.